酶定向进化第8章

酶定向进化第8章2/169蛋白质与酶工程

ProteinandEnzymeEngineering2/169第八章酶定向进化DirectedEvolutionofEnzyme3/169主要内容第一节酶定向进化介绍第二节酶基因体外随机突变第三节酶突变基因的定向选择第四节酶分子定向进化的应用第一节酶定向进化介绍4/169获得具有新功能和特性的酶的途径(2)改造现有已知的酶。5/169(1)从大量未知的生物种系中寻找生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中，并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用。酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。天然酶的作用6/1697/169天然酶的局限性酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求稳定性差活性低使催化效率很低缺乏有商业价值的催化功能天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。8/169现代生物工程对酶的要求1、能具备长期稳定性和活性2、能适用于水及非水相环境3、能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物4、进一步增强酶对多种底物的分解能力

生物的自然进化进化过程：

突变→自然选择→遗传后代进化结果：

基因多样性：为完成同一功能所表现出的

多个基因或同一个基因(同源性)

代谢途径的多样性：同样产物，多条途径

代谢产物的多样性：同一底物，不同产物9/169如何利用相对简单快速的方法对天然酶的改造或构建新的非天然酶？10/169酶的人工改造酶的理性设计(Rationaldesign)酶的定向进化(Directedevolution)11/169酶的理性设计在对酶的空间结构和催化机理有非常充分了解的基础上，对酶的结构进行精确的调控，从而获得具有所需催化活性的新酶12/169理性设计示意图13/169理性设计的不足只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，因而对酶功能的改造较有限。本法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较清楚的酶。当对酶结构不甚了解时，定点突变就无能为力了。14/169定向进化定向进化是模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需要的方向发展的技术过程。15/169定向进化示意图16/169定向进化的分类按照进化对象的不同，分为：分子定向进化细胞定向进化17/169细胞定向进化细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化的过程，以各种细胞为进化对象，目的是改良细胞的各种特征，主要包括微生物细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞的定向进化等。基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技术相结合，对细胞进行基因组重排，从而大幅度增加细胞的正突变频率。18/169分子定向进化分子定向进化是在分子水平上进行定向进化的过程。分子定向进化首先要通过从细胞内提取或者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在体外采用易错PCR、ＤＮＡ重排、基因家族重排等技术进行人工突变，然后进行定向选择而获得所需突变体。19/16920/169酶分子定向进化模拟自然进化过程（随机变异和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。酶分子定向进化的原理定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。

前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的21/16922/169酶定向进化的基本过程随机突变酶基因随机突变构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶反复进行易错PCRDNA重排基因家族重排平板筛选法荧光筛选法噬菌体表面展示法细胞表面展示法核糖体表面展示法高通量筛选定向选择定向进化的选择策略1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。23/169定向进化研究的历史1萌芽阶段首先在分子水平上进行改造单一分子的是SolSpiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体Q进行的试验,证明达尔文的自然选择也可在非细胞体进行.24/1692奠基阶段

1981年，HallBG等报道了他们定向改变了大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。HallBG等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。25/1693发展阶段易错PCR(error-pronePCR)和DNA改组方法被成功开发,标志着酶分子定向进化技术的成熟.1992年GramH．等用噬菌体呈现技术体外筛选抗体时，用易错PCR向抗体的重链可变区和轻链可变区引入突变。Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，

他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐渐增加头孢氨噻的浓度为筛选压力，经过三轮DNA改组获得酶活力增加32000倍的突变体。26/169酶定向进化的意义酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围能够解决理性设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。27/169酶定向进化的用途

(1)提改变酶的特性----多功能或单功能酶(2)提高酶活性---天门冬氨酸氨基转移酶活性提高30倍(3)改变底物特异性和对映异构体选择性----酯酶可水解非天然酯类(4)改变酶的工艺性----冷适应和热适应酶(5)改善酶的稳定性----二体酶变为单体酶或单体酶变为二体酶(6)获取许多新的理论知识28/169酶性质突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCRβ-内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN′稳定性盒式诱变对硝基苯酯酶底物专一性/有机相活性易错PCR/DNA改组胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变β-半乳糖苷酶底物专一性DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗活性/专一性/最佳表达DNA改组酶的体外定向进化应用实例29/169理性设计与非理性设计的对比理性设计（定点突变）

对蛋白结构和功能关系比较清楚，设计一定蛋白结构（如一级结构的氨基酸序列）来改变蛋白功能非理性设计（定向进化）

无需知道蛋白结构和功能关系，直接筛选适合（催化）功能的蛋白酶，再了解这些高活力酶蛋白对应的结构30/169

新酶设计的策略31/16932/169第二节酶基因体外随机突变获取新基因的方法环境样品产酶微生物的筛选微生物发酵产酶酶蛋白的分离纯化酶蛋白的氨基酸序列的测定微生物的分子鉴定数据库中寻找酶蛋白序列酶蛋白序列比对及保守区确定设计简并引物并扩增保守区序列酶基因33/1698.2酶基因体外随机突变8.2.1PCR技术介绍

多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。34/169体内DNA的复制体系DNA聚合酶（IIIIII）拓扑异构酶解旋酶类SSB

引物dNTPMg2+5’3’35/1698.2.1PCR技术介绍

Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段36/1698.2.1PCR技术介绍

TaqP1P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+37/1698.2.1PCR技术介绍

PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性-提供单链模板退火-接上杂交引物延伸-高效聚合核苷酸38/1698.2.1PCR技术介绍

PCR的指数扩增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火39/1698.2.1PCR技术介绍

40/1698.2.2基因体外随机突变方法随机突变方法特点易错PCR技术error-pronePCR从酶的单一基因出发，在特定的反应条件下进行PCR扩增，使碱基配对出现错误而引起基因突变基因重排技术DNAshuffling从两条以上的正突变基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变基因家族重排技术DNAfamilyshuffling从基因家族的若干基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变41/169一、易错PCR技术易错PCR技术(error-pronePCR)是从酶的单一基因出发，在改变反应条件下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。(1)易错PCR反应过程①双链DNA变性：85-95℃②引物与单链DNA退火结合：50-70℃③引物延伸：70-75℃8.2.2基因体外随机突变方法42/169(2)易错PCR反应条件①Mg2+浓度较高，以稳定非互补的碱基对。普通PCRMg2+浓度，易错PCR提高Mg2+浓度。②添加Mn2+，以降低聚合酶对模版的特异性。③4种底物的浓度比改变，即采用浓度不平衡的各种底物，使碱基配对错误出现频率增加。易错PCR具体反应条件要根据进化目的、DNA聚合酶种类和模版情况等多次试验而确定。8.2.2基因体外随机突变方法--易错PCR技术43/16944/169易错PCR示意图8.2.2基因体外随机突变方法--易错PCR技术45/169易错PCR注意事项易错PCR,遗传变化只发生在单一分子内部,所以属于无性进化（asexualevolution）。采用易错PCR时，要控制好适当的突变频率。突变频率太低，难于筛选到理想的正突变体突变频率太高，增加筛选工作量（大多突变为负突变和中性突变）一般情况下,一个目的基因通过易错PCR引起的错配碱基数目控制在2-5个。通常采用连续易错PCR(SequentialerrorpronePCR)：将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板,连续反复进行随机诱变。8.2.2基因体外随机突变方法--易错PCR技术46/169易错PCR应用实例Chen.K和Arnold采用易错PCR对枯草杆菌蛋白酶进行了体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明显提高,其中突变体PC3在60%的DMF中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定向进化,得到的突变体酶活力比PC3还要高3倍。8.2.2基因体外随机突变方法--易错PCR技术47/169易错PCR特点：操作简便，随机突变丰富正突变概率低，突变基因文库较大，筛选工作量大适合较小基因（＜800bp）的定向进化8.2.2基因体外随机突变方法--易错PCR技术48/169二、DNA重排技术DNA重排（DNAshuffling）技术又称DNA改组技术，是从两种以上的同源正突变基因出发，用酶切成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。

此方法又称为有性PCR(SexualPCR),通过将亲本基因群中的突变尽可能组合在一起,以导致更大的变异,最终获得具有最佳突变组合1994年由Stemmer等人首次提出，使用该技术使β-内酰胺酶定向进化，催化效率提高32000倍。8.2.2基因体外随机突变方法49/169DNAshuffling8.2.2基因体外随机突变方法--DNA重排技术50/169基本操作过程:（1）靶基因经随机突变产生含不同突变类型的亲本基因群,用DNaseI随机切割;（2）得到的片段经过不加引物的多次PCR循环,在该过程中,这些片段之间互为引物和模板进行扩增,直至获得全长基因;（3）再加入基因的两端引物进行常规PCR,最终获得发生改组的基因库。8.2.2基因体外随机突变方法--DNA重排技术51/169DNA重排技术原理图1.DNaseI产生随机片段；2.随机片段变性；3.随机片段复性；4.延伸反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段8.2.2基因体外随机突变方法--DNA重排技术52/169DNA重排技术特点正突变体概率高，进化速度较快在获得全长基因之前要除去DNaseI。DNA重排技术的改进交错延伸PCR技术随机引物体外重组技术8.2.2基因体外随机突变方法--DNA重排技术53/1691、交错延伸PCR技术交错延伸PCR(StaggerextensionprocessPCR，StEP)是在PCR反应中,将含不同点突变的模板（两个或多个DNA片段）混合,将常规的退火和延伸合并为一步,并大大缩短其反应时间（55℃，5s）,从而只能合成出非常短的新生链,经变性的新生链再作为引物随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸,此过程反复进行直至获得全长基因。结果会产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。8.2.2基因体外随机突变方法--DNA重排技术DNA重排技术的改进（1）54/169StEP过程1个引物2个模板退火结合延伸产生短片段短片段为引物与模板退火结合继续延伸片段至全长的基因长度分离全长基因，加入外源引物扩增全长基因。8.2.2基因体外随机突变方法--DNA重排技术55/1698.2.2基因体外随机突变方法--DNA重排技术DNA重排技术的改进（1）--交错延伸PCR技术56/1692、随机引物体外重组技术随机引物体外重组技术（random-priminginvitrorecombination，RPR）

采用单链DNA为模板，配合若干条随机序列引物进行PCR反应，产生大量互补于模板不同位点的DNA小片段，然后除去模板，这些DNA小片段互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获得全长突变基因。8.2.2基因体外随机突变方法--DNA重排技术DNA重排技术的改进（2）57/1698.2.2基因体外随机突变方法--DNA重排技术DNA重排技术的改进（2）--随机引物体外重组技术58/169与常规DNA改组相比,RPR技术有如下优点:(1)可利用单链DNA为模板,故可直接用mRNA或cDNA为亲本进行进化。(2)在该方法中,随机片段不是由亲本基因切割获得,故大大降低了亲本DNA的制备量。(3)省去DNaseI切割过程,更为简单。(4)合成的随机引物具有同样长度,无序列倾向性。在理论上,PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变。(5)随机引发合成的DNA片段大小,不受DNA模板长度的限制。8.2.2基因体外随机突变方法--DNA重排技术DNA重排技术的改进（2）--随机引物体外重组技术59/169基因家族重排技术（genefamilyshuffling）又称基因家族改组技术

是从基因家族的若干同源基因出发，用酶（如DNaseI）切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR扩增，使DNA碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。8.2.2基因体外随机突变方法（三）基因家族重排技术60/169DNAshuffling与Familyshuffling：基本过程大致相同出发基因不同8.2.2基因体外随机突变方法--基因家族重排技术61/169当以单一的酶分子基因进行定向进化时,基因的多样化起源于易错PCR等反应中产生的随机突变,所以采用这种过程累积有益突变的速度比较慢。从自然界中存在的基因家族出发,利用它们之间的同源序列进行DNA改组。由于每一个天然酶的基因都经过千百万年的进化,并且基因之间存在比较显著的差异,所以获得的重组基因库充分体现了基因的多样化，排除了不必要的突变，大大加速了基因的体外进化速度。DNAshufflingFamilyshuffling8.2.2基因体外随机突变方法--基因家族重排技术62/169单链化限制性内切酶消化DnaseI消化无外源引物PCR重组基因库片段化同源基因常规PCR3种基因家族改组方法原理图1.常规基因家族改组。2.单链DNA介导的基因家族改组。3.限制性内切酶介导的基因家族改组3种基因家族改组方法获得的突变基因多样性比较

Kikuchi采用后2种改组方法，从儿茶酚2,3-双加氧酶的2个同源基因出发,对其进行体外定向进化的研究。最终筛选到的进化酶在50℃的半衰期分别比两种天然酶延长12和26倍。1007550250123产生的杂合基因百分比8.2.2基因体外随机突变方法--基因家族重排技术63/169第三节酶突变基因的定向选择64/1698.3酶基因突变的定向选择酶基因突变的定向选择是在人工控制条件的特殊环境下，按照人们所设定的进化方向对突变基因进行选择，以获得具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。突变基因基因载体重组DNA突变基因文库目的基因进化酶基因重组组装筛选表达65/169突变基因文库的构建是将各种不同的突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。构建突变基因文库是选择获得所需突变基因的重要步骤，必须注意基因文库的包容性和完整性，以构建丰富多样的高质量的突变基因文库。构建突变基因文库的过程主要包括载体的选择、基因重组、形成基因文库等。8.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建66/169（一）构建基因文库的质量要求构建的突变基因文库必须尽可能地把各种突变基因包含在其中，并且能够完整地反映基因的结构和功能信息。所以突变基因文库不但必须具有包容性，还必须具有突变基因序列的完整性。8.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建67/1691.文库的包容性突变基因文库的包容性是指所构建的文库必须尽可能地包含基因的任何一种可能的突变信息，包括正突变、负突变、和中性突变，以便进行全面的筛选。要求构建的文库必须有足够大的容量，通常一个包容性好的文库应具有106甚至更大的库容量。8.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建（一）构建基因文库的质量要求68/1692.文库的完整性突变基因文库的完整性是指文库中包含的DNA片段必须尽可能完整地反映基因的结构和功能信息，以便通过筛选得到的突变基因能够通过表达获得完整的具有催化功能的进化酶。

（一）构建基因文库的质量要求8.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建69/169（二）构建突变基因文库的主要过程构建突变基因文库的过程主要包括：载体的选择基因重组构建基因文库等。8.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建70/1691.载体的选择突变基因文库的构建，要通过DNA连接酶的作用，将突变基因与适当的载体（vector）重组，所以首先要根据目的基因的特性、载体的特点和重组DNA的筛选方法等选择适宜的载体。质粒载体噬菌体DNA载体黏粒载体噬菌粒载体8.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程71/169（1）质粒载体质粒（plasmid）是存在于微生物细胞内染色体外的遗传单位，是一种闭合环状双链DNA分子。质粒载体是由天然质粒经过人工改造而成的一种常用的基因克隆载体。适用于构建原核生物基因文库、cDNA库和次级克隆。8.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程---载体选择72/169质粒载体特点1.有自主的复制起点2.两种以上的易于检测的选择性标记3.多种限制性内切核酸酶的单一酶切位点4.适合小片段DNA的重组8.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程---载体选择（1）质粒载体73/169(2686bp)74/169（2）噬菌体DNA载体由噬菌体DNA改造而成的具有自我复制能力的载。最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。8.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程---载体选择75/16976/169（3）黏粒载体黏粒（cosmid）是一类人工构建的含有λDNA黏端（cos序列）和质粒复制子的质粒载体，又称柯斯质粒。黏粒载体包括质粒的复制起点、抗性标记基因、多克隆位点和λDNA的cos位点，既可以转化大肠杆菌并按质粒复制的方式进行复制，又可以承载40Kb左右的外源DNA片段。常被用来构建高等生物基因文库常见黏粒载体：pHC79、pJB8、c2RB、cosEMBL8.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程---载体选择77/1698.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程---载体选择黏粒载体的基本属性78/1698.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程---载体选择黏粒载体79/169（4）噬菌粒载体噬菌粒（phagemid）是一类人工构建的有M13单链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点8.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程---载体选择80/169噬菌粒载体的特点：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。常见载体：pUC118、pCU1198.3.1酶基因突变的定向选择--突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程---载体选择81/16982/169基因重组（generecombination）是在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体DNA连接在一起形成重组DNA的技术过程。黏性末端连接平头末端连接修饰末端连接等。8.3.2酶基因突变的定向选择--基因重组83/169（1）黏端连接将载体DNA和目的基因用形成黏性末端(stickyends)的同一种限制性内切核酸酶进行切割，形成黏性末端，按照1：1的比例混合，经过退火处理，使载体DNA与外源DNA的黏性末端结合，形成双链结合体；在T4DNA连接酶的作用下双链结合体连接形成稳定重组DNA分子。8.3.2酶基因突变的定向选择--基因重组84/16985/169（2）平端连接有些限制性内切酶（如HPaI，SmaI等）作用于DNA分子后，形成的末端是平端(bluntends)。具有平端的质粒载体DNA和外源DNA分子，可以在T4DNA连接酶的作用下，形成重组DNA分子。重组效率比黏端连接低很多提高外源DNA和质粒DNA浓度提高T4DNA连接酶浓度降低ATP浓度避免亚精胺等多胺物质的存在8.3.2酶基因突变的定向选择--基因重组86/16987/169（3）修饰末端连接当载体DNA和外源DNA的末端不相匹配时，T4DNA连接酶无法进行连接。所以在连接之前，必须对两个末端或其中一个进行修饰处理，使两种DNA的末端互相匹配，以便于连接，形成重组DNA。主要的修饰方法是引进附加末端。附加末端可以是单链DNA，也可以是双链DNA,可以在一个末端附加，也可以在两个末端都附加。8.3.2酶基因突变的定向选择--基因重组88/169两端加接头89/1691972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。同聚加尾法修饰末端连接（1）---人工加尾形成“粘性末端”

DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补8.3.2酶基因突变的定向选择--基因重组90/169④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点91/169用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。①linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用8.3.2酶基因突变的定向选择--基因重组修饰末端连接（2）---衔接物(linker)连接92/169

93/169

94/169④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：8.3.2酶基因突变的定向选择--基因重组95/1691978年康奈尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用8.3.2酶基因突变的定向选择--基因重组修饰末端连接（3）---DNA接头(adapter)连接法96/169Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接头自我连接97/16998/169接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接8.3.2酶基因突变的定向选择--基因重组99/1695‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！

5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP处理-OHHO-100/169突变文库的组装是将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的重组噬菌体的过程。对于重组质粒载体可以通过细胞转化等方法将重组DNA转入受体细胞，形成突变基因文库对于重组噬菌体DNA载体，需要用噬菌体外壳蛋白将重组DNA进行包装，成为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。8.3.3酶基因突变的定向选择(三)构建突变基因文库101/169大肠杆菌转化（transformation)E.coli感受态细胞感受态制备0℃，0.1MCaCl2加入质粒42℃热激90s，立即冰浴富裕培养抗性筛选LB-抗生素8.3.3酶基因突变的定向选择--构建突变基因文库102/169invitropackagingoflambdaphage103/169重组λ噬菌体转导（transduction)8.3.3酶基因突变的定向选择--构建突变基因文库104/169重组λ噬菌体转导(transduction)105/169根据定向进化的目的要求，在一定的环境条件下进行筛选，从突变基因文库中选取得到所需的突变基因。突变基因文库质粒载体噬菌体载体转化转导目的基因筛选8.3.4酶基因突变的定向选择--突变基因的筛选106/169（一）定向选择环境条件的设定根据定向进化的设定选择环境在每一次“突变——筛选”的循环中加以调整选择环境（1）提高酶的热稳定性：较高温度下培养重组细胞，每次循环提高温度。（2）提高β-内酰胺酶的催化效率：一定浓度的β-内酰胺类抗生素中培养，每次提高浓度8.3.4酶基因突变的定向选择--突变基因的筛选107/169细菌诱发突变的因素50

0C培养突变体库选择压力耐受型突变体一定浓度的β-内酰胺类抗生素8.3.4酶基因突变的定向选择--突变基因的筛选（一）定向选择环境条件的设定108/169（二）高通量筛选技术高通量筛选技术要求：通量大、效率高，在较短时间内简便的判断出正突变基因，并易于排出那些无效的突变基因。常用高通量筛选方法平板筛选法荧光筛选法噬菌体表面展示法细胞表面展示法核糖体表面展示法8.3.4酶基因突变的定向选择--突变基因的筛选109/169（二）高通量筛选技术110/1691、平板筛选法平板筛选方法是将含有随机突变基因的重组细胞，涂布在平板培养基上，在一定条件下培养，依据重组菌细胞的表型鉴定出有效突变基因的筛选方法。特点：简便、快速、直观、容易控制和调整环境条件依据：重组细胞的表型细胞生长情况颜色变化情况透明圈情况8.3.4酶基因突变的定向选择--突变基因的筛选高通量筛选方法111/169（1）依据细胞生长情况筛选突变基因热稳定性：温度梯度和高温环境抗生素耐受性：抗生素浓度梯度pH稳定性：pH梯度极端环境：高盐、低温、

高浓毒物质112/169（2）依据颜色变化筛选突变基因反应产物显色蓝白斑筛选（Bluewhitescreening）：lacZ’AmN2H片段COOH片段113/169（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因C端序列LacZ酶

-galactosidaseBlue/whitescreeningorLacselection诱导物：IPTG底物：X-gal114/169115/169磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚；116/169Homogenizedactivatedsludgesleculturedon1/10-strengthLBplatesamendedwithCPQPandviewedwith(A)whitelightand(B)fluorescentlightrevealingcolonywithhalo(arrow1)andnohalo(arrow2).117/169（3）根据透明圈情况筛选突变基因Starchagar

AmylaseSpiritblueagar

LipaseMethylenebluetributyrin

LipaseSkimmilkagar

CaseinaseNutrientgelatindeep

GelatinaseDNaseagarmethylgreenDNase118/169豆豉纤溶酶（douchifiberolyticenzyme，DFE）血纤维蛋白平板（bloodagar）豆豉纤溶酶安全性能好，溶栓能力强，而且无毒副作用，不引起内出血，半衰期长。119/1692、荧光筛选法荧光筛选法是通过荧光产生与否以及荧光的强度情况进行突变基因筛选的方法。荧光筛选法通常将具有荧光激发特性物质的基因作为报告基因，与突变基因一起克隆到载体中，形成重组细胞，在突变基因表达的同时报告基因也进行表达，由于报告基因的表达产物可以激发荧光，所以通过检测荧光的产生情况，就可以或得能够在重组细胞中表达的突变基因，而将不能表达的无效基因排除。120/169常见的报告基因绿色荧光蛋白(GFP)β-半乳糖苷酶(lacZ)氯霉素乙酰转移酶(CAT)荧光素酶(luc)碱性磷酸酪酶(SEAP)β-葡糖醛酸酶(GUS)等。121/169巨细胞病毒启动子荧光素酶荧光素酶(luc)122/169绿色荧光蛋白(GFP)该蛋白质在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光123/169Afusionof

greenfluorescentprotein

(GFP),

calmodulin,andM13Upperpart:StructureofCa2+-saturatedGCaMP2monomer

Lowerpart:Structureofcalcium-freeGCaMP2.124/169β-半乳糖甘酶基因（lacZ）ONPG：邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷，无色底物替代乳糖，ONP：邻硝基酚，亮黄色的亮黄色无色无色420nm检测125/169126/169珊瑚虫荧光蛋白Anthozoanfluorescentproteins一种珊瑚虫Dendronephthya的双色荧光蛋白，当可见光中的蓝光照射时，发出的光芒由绿色转为红色。127/169辣根过氧化物酶（HRP）基因与单加氧酶基因融合在一起作为报告基因，在有萘存在的条件下可以激发出荧光。128/1693、噬菌体表面展示法Phagesurfacedisplay噬菌体表面展示法是利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使目标外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面的一种分子展示技术。129/169(a)SchematicofM13phagewithphageDNAmodifiedtodisplayaproteinorpeptideasafusiontothecoatproteinpIII.(b)

RepresentationofM13phagewithnanoparticles(blackspheres)nucleatedontopIII(darkblue).(c)

Schematicofametal-orsemiconductor-bindingpeptideisdisplayedoncoatproteinpVIII130/169噬菌体展示库建立过程重组：不同基因分别被插入噬菌体基因组中分离纯化：纯化噬菌体只是展示一个蛋白，多肽或者抗体。文库建成：收集所有的噬菌体就构成一个文库将噬菌体文库与靶蛋白相互作用，筛选能与靶蛋白相互作用的噬菌体131/169外源蛋白与噬菌体外膜结构蛋白的结合方法一种是在构建突变基因文库时，通过基因重组技术，构建外源基因与噬菌体外膜蛋白基因的融合基因，融合基因表达生成外源蛋白与噬菌体外膜蛋白的融合蛋白，再通过噬菌体外膜蛋白的锚定作用而展示在噬菌体表面。另一种方法是外源基因与噬菌体外膜蛋白基因分别与可以相互作用的介导蛋白的基因形成融合基因，表达出来的两种融合蛋白可以通过介导蛋白的相互作用结合在一起，通过噬菌体外膜蛋白的锚定作用而展示在噬菌体表面。132/169pIIIForeignDNAMediatingproteingene133/169134/169135/169淘洗方法：（亲和→洗脱→扩增→亲和）循环淘选（Panning)非筛选（Screening)Panning136/169137/169Typicalmoleculardisplayselectionprocessingasdemonstratedwiththephagedisplaymethod.138/1694、细胞表面展示法细胞表面展示法是通过可以锚定在细胞表面的特定蛋白质与某些外源蛋白质或多肽形成稳定的复合物，使这些外源蛋白或多肽富集在细胞表面的一种分子展示技术。酵母细胞表面展示法细菌表面展示法139/169（1）酵母表面展示法YeastSurfaceDisplay酵母细胞表面展示法是通过锚定在酵母细胞表面的特定蛋白质（凝集素蛋白、絮凝素蛋白等）与某些外源蛋白或多肽形成稳定的复合物，使这些外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种分子展示技术。目前已报道的酵母表面展示系统有三种,即目的蛋白分别与α凝集素、a凝集素或絮凝素融合后，展示于酵母细胞表面。140/169agα1Agα1酵母凝集素的作用aga2aga1Aga1Aga2SSMATα细胞中agα1基因编码α-凝集素（α-agglutinin）Agα1。MATa细胞中aga1和aga2基因分别a-凝集素的两个亚基Aga1、Aga2，二者通过2对二硫键连接。MATα细胞和MATa可以通过Agα1和Aga2的相互作用发生凝集作用（agglutination），在细胞交配中起到重要作用。α-cella-cell141/169酵母细胞表面展示表达系统构成A.载体（1）具有信号肽序列，使已经表达的融合蛋白能够被分泌至细胞外；（2）具有较强的定位结构使融合蛋白固定于细胞表面而不能脱落；（3）与外源蛋白融合后，载体蛋白的定位特性和外源蛋白的生物活性不会改变；（4）在宿主菌株中能稳定存在，不会被细胞壁膜之间和培养基中的蛋白酶水解。142/169B.外源表达蛋白异源靶蛋白根据特定的应用来选择，其性质会影响表达效果，靶蛋白序列中带有许多带电氨基酸残基或者是疏水性残基时将会抑制融合蛋白的分泌，其活性域的空间结构也会影响表达效果。143/169C.宿主菌株一个好的宿主细胞应该无毒、容易培养，能和被展示的蛋白兼容共处且易于筛选。酿酒酵母一直被公认为是安全的模式生物(GRAS)，由于细胞足够大，可以用流式细胞仪进行筛选和分离，非常适合作为展示表达的宿主。144/169①目的蛋白-α凝集素表面展示系统目的蛋白作为N端与α凝集素蛋白的C末端部分融合形成融合蛋白。α凝集素由Agα1基因编码，在加工前具有650个氨基酸。

α凝集素Ｃ端有320个氨基酸残基，含有糖基磷酸酰肌醇（GPI）锚定信号序列。145/169146/169②目的蛋白-a凝集素表面展示系统目的蛋白以C端与a凝集素Aga2p亚基的N端融合进行表面展示。725个氨基酸残基的Aga1p亚基通过β葡聚糖的共价连接而锚定在细胞壁上。69个氨基酸残基的Aga2p亚基通过两对二硫键与Aga1p亚基相连,外源蛋白结果结合在a凝集素Aga2p的C端活性部位而展示在酵母表面。147/169148/169149/169③目的蛋白-絮凝素表面展示系统目的蛋白作为N端与絮凝素蛋白的C末端部分融合形成融合蛋白。絮凝素（flocculin）是絮凝酵母表面的一种细胞壁蛋白，其C端含有GPI锚定附着信号系列，可以与细胞壁中的葡萄糖结合。150/169151/169FlolpC端GPI锚定系统FlolpN端絮凝结构域系统152/169（2）细菌细胞表面展示法

BacterialCellSurfaceDispla把外源基因与细胞表面结构蛋白基因融合，使目的蛋白锚定于细胞表面并获得活性表达的一种