TRB3AMPK信号通路介导肥胖和糖尿病状态下脂肪组织功能紊乱的机制研究

TRB3/AMPK信号通路介导肥胖和糖尿病状态下脂肪组织功能紊乱的机制研究研究背景肥胖和2型糖尿病均是与生活方式密切相关的代谢疾病,二者在全球呈广泛流行趋势。据统计,全世界约有10亿人超重或过度肥胖。胰岛素抵抗是肥胖和2型糖尿病的重要特征。脂肪组织功能紊乱在胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)发生发展中具有重要作用。因此,探讨肥胖和2型糖尿病状态下脂肪组织胰岛素抵抗产生的深层机制,建立以机制为导向的治疗措施成为近年来防治肥胖和糖尿病发生的研究热点。脂肪组织与胰岛素抵抗密切相关。研究发现,脂肪组织不仅仅是一个能量储存器官,还是重要的内分泌器官;作为机体最大的内分泌器官,脂肪组织通过分泌脂肪因子参与调节体内胰岛素靶器官的生物效应。脂肪组织在调节免疫和维持机体糖脂代谢平衡的过程中发挥重要作用。脂肪组织的形态特性、分布、大小、分化程度、分泌功能等与胰岛素敏感性息息相关,然而肥胖和糖尿病状态下,脂肪组织功能紊乱的具体分子机制尚不清楚。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)在脂肪组织功能紊乱的发生、发展中具有不可忽视的作用。机体的脂肪组织、肝脏组织、骨骼肌以及胰腺当中均存在着大量的AMPK,其活化过程主要是通过分解代谢功能的开启以及合成代谢功能的关闭来实现,从而使机体内的代谢与能量平衡处于一种稳态;所以目前AMPK被普遍认为是调控机体能量代谢平衡“总开关”;现有的研究已经表明,AMPK广泛介入了机体主要组织的糖脂代谢调控过程,很有可能会成为防治肥胖和2型糖尿病的一个新靶点。TRB3是调节AMPK信号通路的关键调控蛋白。TRB3基因具有广泛的生物活性,与机体的糖脂代谢以及IR存在着密切的联系。目前已经有大量研究表明,TRB3具有直接调节AMPK的功能,是AMPK信号通路的关键调控蛋白。因此我们推测TRB3可能通过抑制AMPK活性,从而加重脂肪组织糖脂代谢功能紊乱,进而诱导肥胖和糖尿病患者胰岛素抵抗的发生和发展。本研究以胰岛素抵抗脂肪细胞为研究对象,通过腺病毒转染,诱导TRB3基因沉默,综合运用油红O染色和分子生物学技术研究TRB3基因沉默后脂肪细胞功能紊乱的变化,探讨TRB3/AMPK信号传导通路在脂肪细胞胰岛素抵抗中的作用及其可能的分子机制。研究目的通过采用高糖高胰岛素以及软脂酸刺激诱导脂肪细胞,使之出现胰岛素抵抗,从细胞水平探讨TRB3基因沉默对胰岛素抵抗(IR)和AMPK信号通路的影响。实验方法1.诱导培养产生胰岛素抵抗的脂肪细胞小鼠3T3-L1前脂肪细胞购自ATCC。采用“鸡尾酒法”,应用3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤(IBMX)、胰岛素和地塞米松将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。成熟的脂肪细胞经过低糖无血清DMEM的24h预处理,随机分为:对照组和胰岛素抵抗组(IR组);对照组和游离脂肪酸组(FFA组)。对照组使用低糖的DMEM培养,胰岛素抵抗组应用高糖高胰岛素刺激分化成熟的脂肪细胞,即向分化成熟的脂肪细胞中加入高糖(25mM)高胰岛素(10nM)培养基,继续培养24h;游离脂肪酸组应用软脂酸刺激分化成熟的脂肪细胞,即向分化成熟的脂肪细胞中加入软脂酸培养基(0.75mM软脂酸),继续培养24h。2.油红O染色分化成熟的脂肪细胞使用PBS轻轻冲洗两遍,4%多聚甲醛固定15min。然后,PBS洗去多聚甲醛,油红O染液染色30min。多余的染液使用PBS漂去,使用显微镜拍照。3.甘油三酯含量测定提取各组脂肪细胞中的甘油三酯,应用TriglycerideQuantificationKit(Abcam)测定各组脂肪细胞内甘油三酯(TriglycerideTG)的含量4.脂肪细胞葡萄糖摄取实验将每一组脂肪细胞采用培养基(10%FBS+1%2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(2-NBDG)+lnMinsulin)培养30min,弃培养基,PBS重悬细胞,将细胞以l×l04/每孔种在96孔板。在485nm激发波长和535nm发射波长下对每个细胞培养孔的荧光强度进行检测。5.TRB3-siRNA腺病毒体外转染实验脂肪细胞随机分为游离脂肪酸空载体组(FFA+vehicle)、游离脂肪酸TRB3siRNA组(FFA+TRB3siRNA)、胰岛素抵抗空载体组(IR+vehicle)、胰岛素抵抗TRB3siRNA组(IR+TRB3siRNA),胰岛素抵抗脂肪细胞的诱导方法同上。FFA+TRB3siRNA组、IR+TRB3siRNA组的脂肪细胞培养基内加入TRB3腺病毒,培养72h后获取脂肪细胞。6.RealTime-PCR检测收集新鲜的成熟脂肪细胞,应用Trizol法提取mRNA,应用实时定量荧光RealTime-PCR技术检测各组脂肪细胞中TRB3的mRNA相对表达量。7.Westernblot检测获取新鲜成熟脂肪细胞,提取脂肪细胞蛋白质,应用WesternBlot技术检测脂肪细胞中葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、TRB3、磷酸化AMPK(p-AMPK)以及AMPK的蛋白表达水平。实验结果1.胰岛素抵抗脂肪细胞模型建立与对照组相比,高糖+高胰岛素刺激24h后,脂肪细胞IRS-1和GLUT4蛋白表达水平均显著下降(P<0.001);与对照组相比,高糖+高胰岛素刺激24h后,脂肪细胞葡萄糖摄取明显下降(P<0.00l)。与对照组相比,软脂酸刺激脂肪细胞24h后,脂肪细胞的IRS-1和GLUT4蛋白表达水平均显著下降(P<0.001);与对照组相比,软脂酸刺激24h后,脂肪细胞葡萄糖摄取明显下降(P<0.001)。以上实验结果提示,高糖+高胰岛素刺激培养分化成熟的脂肪细胞,出现了胰岛素抵抗;软脂酸刺激培养分化成熟的脂肪细胞也出现了胰岛素抵抗。2.胰岛素抵抗脂肪细胞脂质含量检测油红O染色显示,与对照组相比,高糖+高胰岛素刺激24h后,脂肪细胞内的脂滴体积显著增大,脂滴数量明显增多。甘油三酯试剂盒检测显示,与对照组相比,高糖+高胰岛素刺激24h后,脂肪细胞中的TG含量显著增多(P<0.001)。油红O染色显示,与对照组相比,软脂酸刺激培养24h后,脂肪细胞内脂滴体积明显增大,脂滴数量明显增多。甘油三酯试剂盒检测显示,与对照组相比,软脂酸刺激24h后,脂肪细胞中的TG含量明显增多(P<0.001)。上述结果说明高糖高胰岛素或软脂酸刺激后脂肪细胞内脂质含量增加,提示出现代谢功能障碍。3.胰岛素抵抗对TRB3/AMPK信号通路的影响与对照组相比,IR组脂肪细胞TRB3蛋白表达水平显著增加(P<0.001),AMPK磷酸化水平显著降低(P<0.001)与对照组相比,FFA组脂肪细胞TRB3蛋白表达水平显著增加(P<0.001),AMPK磷酸化水平显著降低(P<0.001)。上述结果说明胰岛素抵抗的脂肪细胞TRB3通路激活,抑制AMPK磷酸化。4.TRB3siRNA转染抑制脂肪细胞TRB3表达RT-PCR结果显示:TRB3siRNA组脂肪细胞TRB3mRNA基因的表达相对于空载体组显著下降(P<0.001)。Westernblot结果显示:TRB3siRNA组脂肪细胞TRB3的蛋白表达水平相对于空载体组显著降低(P<0.01)。说明TRB3腺病毒转染能够有效下调TRB3表达。5.TRB3基因沉默改善脂肪细胞胰岛素抵抗与IR+vehicle组相比,IR+TRB3siRNA组脂肪细胞IRS-1与GLUT4蛋白表达水平明显升高(P<0.001)。与FFA+vehicle组相比,FFA+TRB3siRNA组脂肪细胞IRS-1与GLUT4蛋白表达水平明显升高(P<0.001)。以上结果显示,TRB3基因沉默改善脂肪细胞胰岛素抵抗。6.TRB3基因沉默后AMPK信号通路的改变与IR+vehicle组相比,IR+TRB3siRNA组脂肪细胞中AMPK的磷酸化程度显著升高(P<0.001)。与FFA+vehicle组相比,FFA+TRB3siRNA组脂肪细胞中AMPK的磷酸化水平显著上升(P<0.001)。上述结果说明TRB3基因沉默后AMPK磷酸化增加,从而改善脂肪细胞胰岛素抵抗。结论1.高糖+高胰岛素或软脂酸刺激下脂肪细胞IRS-1和GLUT4的蛋白表达水平均明显降低,葡萄糖转运能力显著下降,甘油三酯含量明显增加,结果提示我们成功构建了胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。2.胰岛素抵抗的脂肪细胞TRB3蛋白表达水平显著增加;TRB3基因沉默后,AMPK的磷酸化水平显著增加,脂肪细胞代谢功能异常得到明显改善,胰岛素抵抗减轻。研究背景肥胖能够引起胰岛素抵抗,而胰岛素抵抗是导致2型糖尿病的重要原因。脂肪组织作为胰岛素抵抗的始发部位,在胰岛素抵抗的发生发展中具有重要作用。脂肪组织功能紊乱在肥胖引起的胰岛素抵抗中发挥重要作用。脂肪组织不仅是储存游离脂肪酸的场所,而且具有复杂的内分泌功能,产生大量的激素和细胞因子,在糖脂代谢的调节中具有重要作用,与代谢综合征、糖尿病和心血管疾病的发生发展密切相关。在肥胖和糖尿病状态下,脂肪组织功能紊乱,是促炎因子的丰富来源,这些促炎因子可直接引起血管损伤、胰岛素抵抗和动脉粥样硬化。然而,调控脂肪组织功能紊乱的具体分子机制尚不清楚。脂肪组织与胰岛素抵抗密切相关。脂肪组织分为内脏脂肪组织、皮下脂肪组织和棕色脂肪组织,以往研宄多集中于各类脂肪组织对胰岛素抵抗的作用,较少有研究对不同类型的脂肪对胰岛素抵抗的作用进行比较,有研究显示,与皮下脂肪组织相比,内脏脂肪组织的增加与胰岛素抵抗关系更为密切;同时,棕色脂肪组织亦与胰岛素抵抗密切相关。脂肪组织胰岛素抵抗的产生与脂肪组织功能紊乱有关,但脂肪组织功能紊乱的机制并不清楚。TRB3可能是介导脂肪组织功能紊乱的关键分子。流行病学显示,在胰岛素抵抗的肥胖患者和2型糖尿病患者中TRB3水平显著增加。我们论文一研宄发现,体外培养的胰岛素抵抗的脂肪细胞TRB3表达显著上调,而TRB3表达下调后脂肪细胞胰岛素敏感性改善。因此,TRB3可能是参与脂肪组织功能紊乱和胰岛素抵抗发生的关键基因。近年研宄证实,TRB3是AMPK信号通路上游的关键负调控因子。AMPK功能失调可导致脂肪组织功能紊乱和胰岛素抵抗的发生。然而,TRB3/AMPK信号通路在肥胖和2型糖尿病大鼠脂肪组织功能紊乱中的作用尚不清楚。在本研究中,我们成功建立了肥胖和2型糖尿病大鼠模型,探讨TRB3基因沉默是否通过调控糖脂代谢和胰岛素抵抗改善脂肪组织功能紊乱及其相关机制。实验方法1.动物模型的建立(1)健康雄性SD大鼠40只,购买于山东中医药大学实验动物中心,大鼠体逋范围120g±20g;随机将SD雄性大鼠(n=40)分为四组:高脂饮食空载体组(HF+vehicle)、高脂饮食TRB3siRNA组(HF+TRB3siRNA)、糖尿病空载体组(DM+vehicle)、糖尿病TRB3siRNA组(DM+TRB3siRNA),按照我们以往实验研宄方法,采用高脂饮食构建肥胖大鼠模型,采用高脂饮食辅以小剂量STZ(27.5mg/kg)构建2型糖尿病大鼠模型。2.TRB3-siRNA腺病毒体内转染实验大鼠造模成功后12周,给予HF+TRB3siRNA组、DM+TRB3siRNA组大鼠颈静脉注射TRB3腺病毒,给予HF+空载体组以及DM+空载体组大鼠颈静脉注射pAdxsi空病毒载体,注射2周以后再经大鼠的颈静脉应用同样方法补充注射一次,TRB3腺病毒注射4周后实施安乐死并留取标本。3.大鼠血液生化指标的测定各组动物禁食12h后,颈静脉取血,分别检测各组大鼠血清中TG(Triglyceride)、总胆固醇(Totalcholesterol,TC)、空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG)和空腹胰岛素(fastinginsulin,FINS)水平,并根据公式(ISMn(FBGxFINS)-1)计算出大鼠的胰岛素敏感指数(insulinsensitivityindex,ISI)。4.Westemblot冰上裂解脂肪和肝脏组织,Bradford法检测总蛋白浓度。一抗使用TRB3(Calbiochem),p-AMPK/AMPK(CellSignalingTechnology)^p-Akt/Akt(CellSignalingTechnology),随后孵育偶联辣根过氧化物酶的二抗。TRB3以P-actin作为内参,磷酸化蛋白以总蛋白作为内参。5.脂肪组织TG和糖原的检测应用TriglycerideQuantificationKit(Abeam)测定各组脂肪组织内甘油三醋(TriglycerideTG)的含量;应用Glucose(HK)assaykit(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)测定各组脂肪组织糖原含量。6.病理学检测取出4%多聚甲醛固定的各组大鼠脂肪组织,脱水浸蜡后石蜡包埋,切5pn切片,HE染色观察脂肪细胞大体形态,Image-proPlus图像分析仪检测附睾及皮下脂肪组织细胞横截面积。肝脏置于4%多聚甲醛固定液浸泡固定24小时后,脱水浸蜡后石蜡包埋,制作如m厚的石蜡切片,用于肝脏HE染色;将置于4%多聚甲醛固定液浸泡固定24小时的肝脏,OCT包埋,制作5Mm厚的冰冻切片,用于肝脏油红O染色,采用Image-proPlus图像分析仪对油红0染色图片进行分析,半定量分析肝脏脂质沉积情况。实验结果1.各组大鼠的一般状况比较实验末,与HF+vehicle组相比,DM+vehicle组实验大鼠的水和食物的摄入量以及排尿量均显著升高(P<0.01?尸<〇.〇〇1)。各组实验大鼠的体重未见统计学差异。2.各组大鼠生化指标的测定实验末,与HF+vehicle组相比,DM+vehicle组实验大鼠的血清空腹血糖(FBG)水平显著升高(尸<0.01),而胰岛素敏感指数(ISI)显著下降(尸<0.01)。另外各组大鼠空腹胰岛素(FINS)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)均未见显著统计学差异。3.TRB3基因沉默改善2型糖尿病大鼠代谢紊乱与DM+vehicle组相比,DM+TRB3siRNA组大鼠的水摄入量以及排尿量均显著下降(尸<〇.〇5?P<0.01),ISI显著增加(P<0.05)。4.TRB3基因沉默改善肥胖和2型糖尿病大鼠脂肪组织重构采用Image-proPlus对各组大鼠附睾及皮下脂肪细胞横截面积进行分析,结果显示:与空载体组相比,TRB3基因沉默显著降低肥胖和2型糖尿病大鼠皮下脂肪和附睾脂肪组织的细胞面积,脂肪细胞排列更加整齐和均匀。同时,TRB3基因沉默减轻了棕色脂肪白色化。5.TRB3基因沉默后脂肪组织糖脂代谢功能的变化与DM+vehicle组相比,DM+TRB3siRNA组附睾脂肪组织中甘油三酯含量显著降低,糖原含量显著增加(PO.05?P<0.01);棕色脂肪组织中甘油三酯含量显著降低(P<0.05),糖原含量无显著性变化。与HF+vehicle组相比,HF+TRB3siRNA组皮下脂肪组织中甘油三酯含量无显著性变化,糖原含量显著增加(P<0.05)。6.TRB3基因沉默后脂肪组织中TRB3表达情况Westernblot结果显示:与HF+vehicle组相比,HF+TRB3siRNA组实验大鼠的三种脂肪组织(EATSATBAT)TRB3表达水平显著均降低(尸<0.001);DM+vehicle组大鼠三种脂肪组织TRB3表达水平均比HF+vehicle组明显增加(P<0.001);与DM+vehicle组相比,DM+TRB3siRNA组实验大鼠的三种脂肪组织TRB3表达水平显著降低(户<0.001)。7.TRB3基因沉默后脂肪组织AMPK信号通路的变化附睾脂肪:与HF+vehicle组相比,HF+TRB3siRNA组实验大鼠的附睾脂肪内p-AMPK蛋白表达水平显著增加(尸<0.001);DM+vehicle组大鼠附睾脂肪内p-AMPK表达水平比HF+vehicle组明显降低(P<0.001);与DM+vehicle组相比,DM+TRB3siRNA组实验大鼠的附睾脂肪内p-AMPK蛋白表达水平显著增力口(F<0.001)。皮下脂肪:与HF+vehicle组相比,HF+TRB3siRNA组实验大鼠的皮下脂肪内p-AMPK蛋白表达水平显著增加(P<0.05);与DM+vehicle组相比,DM+TRB3siRNA组实验大鼠的皮下脂肪内AMPK磷酸化水平未见显著变化。棕色脂肪:与HF+vehicle组相比,HF+TRB3siRNA组实验大鼠的棕色脂肪内p-AMPK蛋白表达水平显著增加(尸<0.001);与DM+vehicle组相比,DM+TRB3siRNA组实验大鼠的棕色脂肪内AMPK磷酸化水平显著增加(P<0.001)。8.TRB3基因沉默后肝脏脂质沉积和肝脏组织重构采用Image-proPlus对各组大鼠肝脏油红?染色图片进行分析,半定量分析结果显示,与HF+vehicle组相比,DM+vehicle组实验大鼠肝细胞内脂质沉积明显増加(P0.001);与HF+vehi