Western-Blot-蛋白质双向电泳

WesternBlot&蛋白质双向电泳小组成员：姜洪扬张富赟贺博刘宇星旷亦瑾韦雨石岸灵丁冬林琼王祖佳赵俊雅概念WesternBlotWesternblot是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测方法，又称蛋白印迹或免疫印迹，用于检测固定在固相基质上的蛋白质，是当代分析和鉴定蛋白质的最有效的技术之一。基本原理WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。WesternBlot操作步骤1.蛋白质样品制备

在细胞悬液中加入含蛋白质酶抑制剂的蛋白质抽提液，破碎细胞，离心后收集上清液并测定蛋白质浓度。Westernblot操作步骤2.SDS法分离SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS）技术是分离蛋白质的常用技术之一。先配制30%的丙烯酰胺和2%的甲叉双丙烯酰胺储备液，再制备分离胶和浓缩胶。（先制备分离胶，带分离胶聚合后，再制备浓缩胶，并插上梳板。）

Westernblot操作步骤3.蛋白质转膜电泳结束后，把凝胶浸泡在膜缓冲液中，轻轻摇动20min，以去除凝胶上吸附的电泳缓冲液中的盐与去污剂。依次在半干型电泳转移槽正极板上铺两层正极缓冲溶液Ⅰ湿滤纸，一层正极缓冲液Ⅱ湿滤纸，膜、凝胶、三层负极缓冲液湿滤纸。在膜上做好标记以便定位，并驱除每层间的气泡，盖上负极板，接通电源进行转移。Westernblot操作步骤4.封闭

标记抗体与膜上蛋白质抗原杂交

封闭主要是为了降低抗体与膜的非特异性结合。把膜浸泡在封闭液中，4°C轻轻摇晃过夜。Westernblot操作步骤5.检测并分析标记物信号①一抗（鼠抗人）以1:1000比例稀释与20ml抗体稀释液中，加于膜上，室温1~2h。②洗去游离的一抗后，加入生物素连接的二抗（羊抗鼠，1:1000稀释）室温1h。③洗去二抗后，加入Avidin（抗生素蛋白）-生物素辣根过的氧化物酶（HRP）反应30~60min，使二抗、Avidin、生物素化HRP充分结合。④洗去游离的HRP后，立即用ECL化学发光剂进行信号检测。Westernblot操作步骤Westernblot应用Westernblot法应用分子生物学、生物化学和免疫遗传学中时常会用到的一种实验方法，蛋白质分析中应用的Western杂交法是把电流分离的组分从凝胶转移至一种固相支持体，并以针对特定氨基酸所制备的特异性样品作为探针检测其相同或相似序列。WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。它能够从生物组织的粗提物或部分纯化的粗提物中检测和识别几种特异的蛋白质。这一技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。因此要对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量时，Westernblot法极为有用Westernblot概念蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳是最主要的基于胶的蛋白质组学分离技术。具有高灵敏度和高分辨率、便于计算机进行图像处理分析、可很好地与质谱分析匹配等优点基本原理从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。蛋白质双向电泳提取的总蛋白溶液等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离SDS分离，使得蛋白质按分子量大小排序分子量大小通过双向电泳使得不同等电点和分子量的蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同位置从而实现蛋白质的双向分离操作步骤*样品制备*IPG条重泡涨及上样*第一向：IEF*IPG条平衡*第二向：SDS*胶条染色*成像及图像分析蛋白质双向电泳（1）样品制备：溶解预处理细胞(清洗等)破碎细胞蛋白质沉淀除杂质（DNA、RNA等）为什么要进行样品制备？蛋白质双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点。待研究样本常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。双向电泳的最关键步骤之一原则：尽可能多地提取出总蛋白质，注意防止样品提取过程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质（2）IPG条重泡涨及上样：取大约30-60μg的蛋白与溶胀液混合，总体积为250μL。放置胶条：胶条酸性端（尖端）朝阳极（尖端）方向放入胶条槽，慢慢下压，最后放下胶条碱性端（平端），使溶液浸湿整个胶条，避免生成气泡。蛋白与溶胀液混合物加入胶条槽从酸性端去掉胶条的保护膜在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。将胶条槽平放于IPGphor仪器上，与水平方向垂直。（3）第一向：等点聚焦设置IPGphor仪器的运行参数。工作温度20℃，每胶条最大电流50μA。以下为电压设定情况：

支架盖IPG

胶条电极电极垫电压（V）升压模式电泳时间电压（V）升压模式电泳时间30Step-n-hold12hr1000Step-n-hold1hr200Step-n-hold1hr8000Gradient3hr500Step-n-hold1hr（4）IPG胶条的平衡平衡缓冲液Ⅰ含DTT使变性的非烷基化蛋白处于还原状态平衡缓冲液Ⅱ含碘乙酰胺使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化将胶条放入平衡缓冲液Ⅰ中，封口，在摇床上振荡15min。将胶条取出放入平衡缓冲液Ⅱ中，封口，在摇床上振荡15min。用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，去除多余的液体。使蛋白质按照分子量的大小不同而分离无需浓缩胶，因为第一向等电聚焦已经使得蛋白得到浓缩（5）第二向:SDSSDSSDSSDS向电泳缓冲液中加

0.5%的琼脂糖SDS标记纸片IPG胶条硝酸银染色优点：灵敏度高，缺点：重复性差，质谱兼容性低考马斯亮兰染色：优点：重复性好，质谱兼容性高缺点：灵敏度低荧光染色：优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高缺点：价格贵其它染色方法：胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等（6）胶条染色硝酸银染色图谱考马斯亮蓝染色图谱荧光染色图谱（7）成像及图像分析典型流程凝胶图像的扫描图像加工斑点检测和定量凝胶配比数据分析数据呈递和解释2-DE数据库的建立2-DE分离的可溶性

E.coli蛋白注意事项（1）根据预分离蛋白质的相对分子质量范围确定使用的凝胶的浓度。（2）凝胶染色方法众多，其主要区别是灵敏度不同，需根据实际需要选择。通常考马斯亮蓝染色能检测到约含量为1μg的蛋白质点，硝酸银染色法能检测到含量为ng级的蛋白质点。（3）离子是等电聚焦过程中比较大的干扰因素，在实验过程中应该尽量避免引入离子。如蛋白质提取方法的确定，使用去离子水等。（4）如果双向电泳分离的蛋白质点需进行质谱鉴定，那么需要注意选择对质谱没有干扰的染色方法。（5）重复性是双向电泳需要注意的问题之一，所以在操作过程中应保持试剂、操作过程、实验条件的一致性，以确保双向电泳的重复性，从而获得可靠的可比性。应用*双向电泳技术在蛋