2009年深圳地区杯状病毒感染的分子流行病学特征

2009年深圳地区杯状病毒感染的分子流行病学特征研究背景和目的：诺如病毒(Norovirus,NoV)最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原,并以发现地将其命名为诺瓦克病毒(Norwalkvirus,NLVs)。由于该病毒无法进行细胞培养,不能建立动物模型,亦没有敏感的诊断技术,所以在较长时间里(约20年),只能用电镜进行小规模的粪便标本检测。最初,这类病毒以电镜下的形态和发现地点命名和分类,随着病毒种类的增多,该种命名和分类的方式很容易引起混乱的缺点日趋明显。目前病毒的分类和命名主要根据病毒形态学、抗原特性、宿主范围和所致疾病的临床症状,特别是病毒基因组序列和结构以及遗传学进化分析的结果进行。经杯状病毒组研究组(calicivirusstudygroup,CSG)1998年建议,国际病毒分类委员会(theinternationalcommitteeontaxonomyofviruses,ICTV)批准,将杯状病毒分为四个属,分别是：①Lagovirus:以兔出血病病毒(rabbithemorrhagicdiseasevirus)为代表：②NoV;③SaV(Sapovirus,SaV);④Vesivirus:以猪水泡疹病毒(swinevesicularexanthemavirus)为代表。其中Lagovirus和Vesivirus感染动物；而NoV和SaV主要感染人,二者又合称为人类杯状病毒(HumanCalicivirus,HuCV)。20世纪90年代初,NoV病毒的成功克隆和测序分析,大大推动了杯状病毒的研究,并且分子生物学技术和生物信息学的飞速发展,进一步为NoV的深入研究提供了便利条件,对NoV引起急性胃肠炎(acutgastroenteritis,AGE)的危害和意义逐渐得到了充分认识。NoV作为引起人类AGE爆发和散发的重要病原体之一,具有典型季节相关性,在世界各地都有广泛传播,能够感染所有的年龄组人群,极易引起爆发,成为难以控制的胃肠炎疾病,极大影响着人群公共健康。NoV的共同特征是：直径约为26-35nm,无包膜,表面粗糙,球形,呈20面体对称；可从AGE病人的粪便中分离得到,但不能在细胞或组织中培养,也没有合适的动物模型；基因组为无包裹的单股正链RNA病毒,RNA链全长约7.7kb,包括3个开放阅读框(openreadingframe,ORFs):ORF1基因全长5100bp,位于基因组中5-5104nt之间,编码一种具有保守序列的多聚酶非结构蛋白,此结构蛋白可裂解为p48、NTPase、p22、vpg、3c-likeprotein和polymerase6个小蛋白；ORF2基因全长1632bp,位于基因组中5085～6707nt之间,编码一种分子量约为56KD的衣壳蛋白VP1;ORF3基因全长807bp,位于基因组中6707-7513nt之间,编码一种约为22.5KD的微小结构蛋白VP2。NoV具有高度的基因多样性,被分为5个遗传组,其中GⅠ、GⅡ、GⅣ仅感染人类,而GⅢ、GⅤ分别感染牛和鼠。GⅠ和GⅡ又至少可以进一步划分为8和17个基因型,GⅢ分为两个基因型,另外检测出新的基因型被定义为GⅡ.b型。NoV之所以具有高度的遗传多样性,主要是因为RNA依赖性RNA聚合酶(RNAdependentRNAPolymerase,RdRp)缺乏校正功能而引起核苷酸位点突变以及不同病毒株间基因重组。SaV属于HuCV的另一种属,首次发现于1976年,也是引起人类AGE爆发和散发的重要病原体,在世界各地都有广泛传播,能够感染所有的年龄组人群。由于SaV引起的感染不如NoV严重,因此对SaV的重视程度和研究深度也均不如NoV。SaV是一种未被包裹的单股正链RNA病毒,其基因组RNA链全长约7.3-7.5kb,包括3个开放阅读框(ORFs)。ORF1编码结构蛋白(衣壳蛋白,capsidprotein)和非结构蛋白(RdRp);ORF2编码一种基本小蛋白；ORF3与ORF1交迭,只存在于GⅠ、GⅣ、GⅤ型中,编码一种未知功能的蛋白。SaV根据RNA聚合酶区和衣壳蛋白区的基因多样性,可以进一步分为5个遗传组,其中GⅠ型、GⅡ型、GⅣ型和GⅤ型主要感染人,GⅢ主要感染猪。病毒性胃肠炎是世界各国高发疾病之一,尤其在发展中国家,因胃肠炎疾病死亡的儿童人数高于发达国家。随着研究的深入,HuCV尤其是NoV的感染在急性非细菌性腹泻中的地位越来越重要,仅次于RV感染。我国NoV感染十分普遍,优势毒株分布虽各地有所差异,但主要以GⅡ.4型为主,对不同地区NoV感染型别是否有变异、优势株是否发生变化的鉴定及分析可以丰富我国NoV的研究资料,对于进一步了解NoV进化具有重要意义。虽然国内外对SaV的研究不是很深入,但是近年来的研究数据表明由SaV引起的疾病暴发有增加趋势。为此,我们对2009年深圳地区腹泻患者HuCV的流行情况及型别进行了研究,以了解当地NoV和SaV基因型别分布特征,探讨流行的优势毒株；分析深圳地区HuCV的流行特征,丰富南方腹泻病毒感染的相关资料,为我国腹泻感染提供分子生物学基础和流行病学背景资料。方法：1.以深圳龙岗中心医院、北大深圳医院、龙华人民医院和西乡人民医院等医院为监测哨点医院,按监测方案要求采集病毒性腹泻病例粪便标本。收集2009年病毒性腹泻患儿粪便标本,每份标本取样5～10g或5～10ml。病毒性腹泻病例定义为大便次数≥3次/d,呈水样、蛋花样或稀糊样便,常规镜检WBC<15,RBC=0,排除常见细菌、寄生虫等感染的腹泻病例。2.对所有标本进行核酸提取,用三对分型引物GISKF/GISKR、COG2F/GIISKR和SLV5317/SLV5749一步法三重RT-PCR扩增NoV和SaV的衣壳区(Capsid),PCR产物纯化回收、测序,应用BLAST将测序结果在GenBank上寻找与各株同源序列,应用ClustalW进行多序列对比分析和MEGA4.0构建遗传进化树,进行NoV和SaV基因型别分析,判断NoV和SaV流行优势株。3.运用统计软件SPSS17.0对收集的患者资料进行统计分析(卡方检验),分析深圳地区杯状病毒感染的流行概况。结果：1.深圳地区HuCV感染全年均可发病,NoV感染主要发生在5一10月份,SaV感染主要发生在春秋冬季节；NoV和SaV感染在不同月份之间存在差异,具有统计学意义。NoV和SaV感染检出率在不同性别和年龄段之间没有显著性差异。2.本研究对收集的852份腹泻患者粪便样本进行检测,共检出67株NoVGⅡ型,检出率为7.86%；3株NoVGⅠ型,检出率为0.35%；对随机抽取的32株NoVGⅡ型和3株GⅠ型样本,分别进行遗传进化分析：其中22株属于NoVGⅡ.4型,6株属于NoVGⅡ.3型,2株属于NoVGⅡ.12型,GⅡ.2型和GⅡ.14型各有一例；3株NoVGⅠ型分属于三个型别：GⅠ.1、GⅠ.3和GI.4型。3.16株测序SaV样本中8株属于G1型(3株为GⅠ.1,5株为GⅠ.2),7株属于GⅣ型,1株属于GⅡ.1型。4.JB030920397和JB030920633两株不能归为现存的NoVGⅡ.3亚型a-c,为新发现的GⅡ.3亚型；SaVGⅣ型为国内首次报道的SaV基因型别。结论：深圳地区HuCV感染全年均可发病,NoV感染主要发生在夏季,SaV感染主要发生在春秋季节；NoV和SaV感染除了在不同月份之间有统计学意义,在不同性别和年龄段之