岩藻聚糖在化学污染及慢性肾功能不全伴不育小鼠模型附睾表达研究

岩藻聚糖在化学污染及慢性肾功能不全伴不育小鼠模型附睾表达研究近年来,男性因素所致不孕不育症发病率呈增高趋势。临床调查发现,肾脏疾病及环境污染因素致使精子发育异常引起的不孕不育病例明显增加,精子成熟的分子生物学研究具有极强的临床应用前景。正常生理条件下,精子在睾丸生精小管内生成并高度分化,但尚未完全成熟,在通过附睾管运行过程中,经与附睾管腔液微环境中的相关因子作用,获得运动能力后方具备使卵子受精的潜能。附睾分为起始部、头部、体部、尾部四部分,头部由睾丸输出小管组成,体、尾部由附睾管组成,尾部与输精管相连。精子成熟开始于附睾头部,附睾上皮分泌的蛋白通过参与精子质膜在顶体反应、精卵识别和融合中的作用来调控精子的成熟和获能。文献报道人精浆(雄性生殖道分泌的蛋白、糖蛋白、肽等多种分泌物的混合物)中游离岩藻聚糖含量达到0.3-0.4mg/ml,并富含Le~X和Le~Y的抗原决定基和大量糖基转移酶,推测岩藻聚糖序列可能具有增强精子前向运动能力、促进雌性输卵管中精卵的结合和免疫抑制等作用。Lewis聚糖是岩藻糖化的乳糖系列聚糖,根据其糖链结构不同分为Le~X、Le~Y、Le~a、Le~b、sLe~X等,而Le~X、Le~Y的差异只是末端岩藻糖Fucα1-2的有无。Lewis聚糖与个体发育、器官形成、造血细胞分化及肿瘤发生转移密切相关。我们对Lewis聚糖在雌性生殖系统中的功能研究显示:岩藻聚糖抗原Le~Y在着床期子宫内膜细胞和胚泡中持续高表达,在卵巢激素调节下作为信息分子参与母-胎识别、黏附和调控着床。催化Lewis聚糖合成的关键酶(岩藻糖基转移酶FUTs)在围着床期子宫内膜表达趋势与Lewis聚糖蛋白表达一致,说明寡糖合成受其合成关键酶基因调控。肾脏病由于肾脏排泄、内分泌、免疫及代谢等功能发生的一系列病理生理改变,使机体内环境紊乱,最终导致其它器官发生病变。建立一个类似人体的动物肾脏病模型,有利于对肾脏疾病及其诱发疾病的研究。镉作为橡胶制品、电池、香烟、肥料中的重要成分,是已知最易在体内蓄积的环境毒物;研究表明,少量的镉进入人体即可通过生物放大作用和生物积累,对动物器官特别是对生殖系统器官产生毒性作用。本实验首先探讨建立两个动物模型:一个是应用氯化镉模拟化学污染造成的损害模型,另一个是应用腺嘌呤模拟慢性肾功能不全的模型,从而比较附睾中的Le~X、Le~Y糖蛋白正常状态和这两种模拟病态状态下的分泌、表达有什么不同。(一)化学污染小鼠模型及慢性肾功能不全伴随不育小鼠模型制备通过小鼠死亡情况、体重变化情况、大体形态学、组织病理学方法检测各项指标,对检测结果综合分析:选用C57雄性小鼠用氯化镉制作化学污染小鼠模型通过检测得出的结果是应用1.5mg/kg剂量组制作模型符合实验设计要求。选用昆明雄性小鼠,用含0.4%腺嘌呤药物饲养组、模型小剂量组(腺嘌呤300mg/kg)和模型大剂量组(腺嘌呤500mg/kg),确定应用0.4%药物饲养制作的动物模型符合实验设计要求。(二)RT-PCR技术检测氯化镉组:Le~X、Le~Y合成的关键酶基因FUT9和FUT1、FUT4在附睾头、体、尾中的表达实验组明显低于对照组,说明氯化镉抑制了Le~X、Le~Y的合成。腺嘌呤组:FUT9和FUT1、FUT4在附睾头、体、尾的表达实验组高于正常组。腺嘌呤刺激上调了Le~X、Le~Y合成。(三)免疫组化技术检测结果氯化镉化学污染模型组:在睾丸中,实验组和对照组均未见Le~X、Le~Y表达。在附睾头部,实验组Le~X的表达主要在管腔少量分泌物中,对照组Le~X阳性表达主要分布在管壁细胞;在附睾体、尾Le~X的表达实验组低于对照组。Le~Y的分布与表达强度和Le~X相似。结果分析显示,氯化镉能使实验组附睾的管壁细胞和管腔分泌物中Le~X和Le~Y的表达都明显降低。腺嘌呤模拟慢性肾功能不全的模型组:Le~X在睾丸中未见阳性表达;在附睾头部表达主要分布在管壁和管腔分泌物中,而对照组主要分布在管壁。实验组Le~X在附睾体、尾表达高于对照组。Le~Y在睾丸中各组均未见阳性表达;在附睾的头、体、尾实验组与对照组的Le~Y分布无差异,表达强度略高于对照组。(四)Western–blot技术检测结果氯化镉组:实验组的Le~X和Le~Y蛋白在附睾头、体、尾及睾丸中表达量与对照组相比明显降低。腺嘌呤组:附睾头、体、尾及睾丸中均有Le~X和Le~Y蛋白表达。实验组