凝血因子Ⅶ启动子区甲基化调控基因表达及与颅脑创伤后进展性出血性损伤相关性研究

凝血因子Ⅶ启动子区甲基化调控基因表达及与颅脑创伤后进展性出血性损伤相关性研究本课题分三部分,第一部分从临床角度阐述单纯性颅脑创伤(traumaticbraininjury,TBI)患者血浆凝血因子VII活性(coagulationfactorVIIactivity,CFVIIa)水平与颅内进展性出血性损伤(progressivehemorrhagicinjury,PHI)的相关性;第二和第三部分分别从细胞和临床角度研究凝血因子VII(coagulationfactorVII,CFVII)启动子区甲基化对CFVII基因表达调控作用及与PHI的相关性。各部分研究摘要如下:第一部分单纯性颅脑创伤患者血浆凝血因子VII活性水平与颅内进展性出血性损伤的相关性目的:研究单纯性TBI患者血浆CFVIIa水平与PHI的相关性。方法:根据研究纳入和排除标准选取2010年8月至2014年6月在上海华山医院神经创伤中心急诊入院的年龄≥17岁的中重度单纯性TBI患者112例,采集患者入院时外周静脉血标本并送检国际标准化比值(internationalnormalizedratio,INR)、活化部分凝血活酶时间(activeatedpartialthromboplastingtime,APTT)、血小板(platelet,PLT)、D-二聚体、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)及CFVIIa。每24h随访患者头颅CT一次,当再次CT扫描较首次CT扫描显示的出血性病灶扩大或有新出现的出血性病灶时被诊断为PHI。结果:PHI组患者血浆CFVIIa及PLT水平均显著低于非PHI组(77.79%±22.82%VS100.32%±30.39%;126.95±48.46VS148.13±53.41;P<0.05);PHI组患者血浆APTT、INR、D-二聚体、FIB均高于非PHI组,但两组之间差异不明显(P>0.05)。Logistic回归分析,结果显示血浆CFVIIa低下(OR=1.06,95%CI=1.03~1.10,P<0.001)及PLT水平降低(OR=1.01,95%CI=1.00~1.02,P=0.009)是单纯性TBI患者发生PHI的独立危险因素。结论:单纯性TBI后PHI患者血浆CFVIIa及PLT水平均显著低于非PHI患者,血浆CFVIIa低下及PLT水平降低是单纯性TBI患者发生PHI的独立危险因素。第二部分凝血因子VII启动子区甲基化调控凝血因子VII表达目的:研究CFVII基因启动子区甲基化对CFVII表达调控作用。方法:基因合成CFVII启动子区-781--1bp及-1000--1bp两条片段,并将上述片段亚克隆至PGL3-basic载体,获得重组质粒PGL3-F7UM-781--1、PGL3-F7UM-1000--1。酶切、测序验证无误后,用甲基化转移酶(M.SssI,NEB)对重组质粒、PGL3-Basic、PGL3-Control质粒进行全甲基化修饰得到甲基化质粒。本实验共分9组,分别为无转染对照、PGL3-Basic(UM)、PGL3-Basic(M)、PGL3-Control(UM)、PGL3-Control(M)、PGL3-F7UM-781--1、PGL3-F7M-781--1、PGL3-F7UM-1000--1、PGL3-F7M-1000--1。利用脂质体转染试剂分别将以上质粒及对照质粒PRL-TK转染入人肝癌细胞(HepG2),检测荧光素酶活性。结果:各组甲基化质粒较未甲基化质粒荧光素酶表达水平均显著降低(P<0.001)。其中PGL3-F7M-781--1组荧光素酶表达较PGL3-F7UM-781--1组下降了约110倍(P<0.001);而PGL3-F7M-1000--1组较PGL3-F7UM-1000--1组荧光素酶表达下降约244倍(P<0.001)。两组非甲基化重组质粒荧光素酶表达水平无明显差异(P=0.28);而两组甲基化重组质粒荧光素酶表达水平差异有统计学意义(P<0.001)。结论:CFVII启动子区甲基化影响CFVII基因表达,启动子区高甲基化将导致CFVII基因表达降低。位于启动子区-781bp至-1000bp之间的CpG甲基化对CFVII基因表达影响更显著。第三部分单纯性颅脑创伤患者血浆凝血因子VII启动子区甲基化与凝血因子VII活性水平及颅内进展性出血性损伤相关性研究目的:研究单纯性TBI患者血浆CFVII启动子区甲基化水平与血浆CFVIIa水平之间关系,并探讨CFVII启动子区甲基化与PHI的相关性。方法:选取符合条件的中重度单纯性TBI患者79例,采集患者入院时外周静脉血,并送检CFVIIa、PLT、APTT、INR、FIB、D-二聚体。提取患者血液基因组DNA,并对其进行亚硫酸氢盐处理,设计合成引物,PCR扩增目的基因片段,采用Sequenom质谱法检测患者CFVII启动子区甲基化水平。本实验共采用两种分组方法:CFVIIa≥90%组与CFVIIa<90%组,PHI组与非PHI组。PHI定义与前述相同。结果:采用独立样本T检验对所研究的FVII启动子区CpG位点进行比较发现:CFVIIa≥90%组与CFVIIa<90%组患者CpG3位点甲基化率有显著性差异(0.83±0.05VS0.85±0.03,P<0.05),CFVIIa≥90%组患者CpG3位点甲基化率小于CFVIIa<90%组;而两组患者CpG2、CpG4、CpG5、CpG6等位点甲基化率无显著性差异(P>0.05);PHI组与非P