β内酰胺酶(拮抗剂)杯碟法等检测方法-内部资料

β内酰胺酶（拮抗剂）管控与检测方法现场讲解深圳市易瑞生物技术有限公司

主要内容主要内容：深圳市易瑞生物技术有限公司简介认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）β内酰胺酶（拮抗剂）的检测方法深圳易瑞β内酰胺酶产品操作培训牧场β内酰胺酶的建议管控方法区分内源性与外源性β内酰胺酶的方法移液枪操作注意事项深圳市易瑞生物技术有限公司简介公司简介：企业成长趋势与相关荣誉企业承担部分国家科研项目企业部分专利企业产品第三方验证报告易瑞生物产品简介深圳市易瑞生物技术有限公司简介企业成长趋势与相关荣誉深圳市易瑞生物技术有限公司简介企业承担部分国家科研项目科技部科技型中小企业技术创新基金项目（项目编号：09C26214425280）科技部国际科技合作专项项目（项目编号：2011DFA32930）国家“十二五”科技支撑计划项目（项目编号：

2012BAK17B10）科技部科技型中小企业技术创新基金（项目编号：

13C26214424714

）深圳市科技研发资金技术研究开发计划——深港创新圈合作研发项目（项目编号：JSE201109160036A）深圳市2013技术创新计划技术攻关项目（项目编号：重2013-027）深圳市战略新兴产业发展专项资金项目（项目编号：

CXZZ20120615163555764）深圳市技术研究开发计划-国际科技合作项目（项目编号：

ZYA201007070114A）深圳市易瑞生物技术有限公司简介企业部分专利（已申请和授权专利15项，包括国际专利（PCT））一种提高竞争免疫分析灵敏性的方法（2012102333772）利用免疫层析技术区分检测具有相似分子结构的小分子（201210547765.8）一种超灵敏、定量免疫层析装置及检测方法（2011102041572）具有壳核结构的磁性荧光纳米颗粒的制备方法及应用（2011102956054）瘦肉精联检试纸条（201220716928.6）硝基呋喃代谢物检测装置（2013200116973）孔雀石绿快速检测装置（2013200355298）氯霉素快速检测装置（2013200469049）β-激动剂类药物检测装置及方法（2012100015099）深圳市易瑞生物技术有限公司简介企业承担部分国家科研项目国家乳制品质量监督检验中心国家兽药残留基准实验室（华南农业大学）国家水产品质量监督检验中心农业部渔业产品质量监督检验测试中心（南京）技术复核鉴定：

深圳市易瑞生物技术有限公司生产的试纸条：简便、快速、灵敏；检测结果与液相串联质谱法测定结果相符。深圳市易瑞生物技术有限公司简介易瑞生物部分产品简介认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）什么是β内酰胺酶β内酰胺酶的单位β内酰胺酶的分类β内酰胺酶的来源β内酰胺酶的危害认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）什么是β内酰胺酶

β-内酰胺酶是由多种酶组成的酶家族，是一种由细菌产生的能水解β-内酰胺类抗生素的酶。这些酶的基因存在于细菌的染色体或质粒中。β-内酰胺酶的产生是细菌对(β内酰胺类)抗菌药物耐药最常见的机制，在各种耐药机制中占80%；绝大多数致病菌产生青霉素类和头孢菌素类耐药性的主要原因即为耐药菌产β内酰胺酶所致。

特别注意：

1个产超广谱β内酶胺酶（ESBL）菌株在生鲜牛乳体外培养过程中能够产生内源性β-内酰胺酶的活力（50~85U/ml）。认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）什么是β内酰胺酶其他相关文献指出：

1.兽医临床统计试验表明：患病乳牛长期使用β-内酰胺类抗生素导致细菌产生耐药性；耐药菌自身能够代谢产生β-内酰胺酶；不同区域分布、不同品种乳牛、不同类型的抗生素使用之后内源性β-内酰胺酶的在奶中的分布情况各不相同。2.引起乳房炎的主要病原菌对青、链霉素有很强的耐药性。在杯碟法培养中如果存在耐药菌即使无β-内酰胺酶添加也不能产生青霉素抑菌圈（内源性酶杯碟法一样可以检出）。认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）β内酰胺酶的单位

1.《中国药典》（2005版）定义的β-内酰胺酶活力单位为：规范化的β-内酰胺酶活性浓度标识U/mL，这里的活性单位U特指：37℃，每小时分解青霉素活性单位的量。2.β-内酰胺酶的活性单位定义为：在特定条件下（37℃），1分钟内转化1微摩尔底物（青霉素），或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU）。

由以上内容可知：因活性无法准确获得，且抗原抗体反应的量受样本基质等均有影响，在U与IU两个单位间无绝对的换算关系。

认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）β内酰胺酶的来源

内源性：β-内酰胺酶是一种耐药菌所特有的分解抗生素的酶，这种酶能分解β-内酰胺类的抗生素，比如青霉素、头孢等都属于β-内酰胺类的抗生素。而β-内酰胺类抗生素是应用最广泛的抗生素，用于治疗牛乳腺炎和其他细菌感染性疾病。因此，牛奶中检测出β-内酰胺酶很可能是奶牛体内自身细菌耐药性产生的；

外源性：首先在清洗有β内酰胺类抗生素奶残留的奶罐时作为拮抗剂使用，使得β内酰胺酶残留到新灌入的生奶中；其次是人为加入β-内酰胺酶，因为它能分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素，为抗生素打掩护。（目前已有区分内源性与外源性的具体方法，详询易瑞工程师）认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）β内酰胺酶的分类

β-内酰胺酶按照降解产物可分为4类：第一类为头孢菌素酶第二类为青霉素酶和超广谱酶第三类为金属酶第四类为其他不能被克拉维酸完全抑制的青霉素酶（应用最广泛的为前两类）

β内酰胺酶按照抑制剂作用可分为3类：舒巴坦敏感的β内酰胺酶（杯碟法检测该类）克拉维酸敏感的β内酰胺酶他唑巴坦敏感的β内酰胺酶（对β酶的抑制作用强度依次为：他唑巴坦>舒巴坦>克拉维酸）认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）认识牛乳中的β内酰胺酶（拮抗剂）β内酰胺酶的危害随着抗生素的不合理应用，细菌的耐药性随之产生，细菌产生耐药性的原因很多，β-内酰胺酶仍是细菌对抗生素耐药的主要原因，微量的β—内酰胺酶对人体不会产生明显的危害。β—内酰胺酶的本质是一种蛋白，摄入体内之后，会被分解，不会长期存在体内；但是，病人在服用β—内酰胺类抗生素后，再喝下含有β—内酰胺酶的牛奶，那么抗生素的作用就会减弱，从而影响疾病的治疗。时间久了，临床上将无药可用，即产生所谓的超级细菌。同时，对于未杀菌的鲜奶喝入人体后，耐药菌将长期生存在人体内使得人体对于抗生素药物产生耐药性，最终因抗生素药物治疗无效导致某些寻常疾病因无药可救而夺去人类性命。β内酰胺酶（拮抗剂）的检测方法β内酰胺酶（拮抗剂）的检测方法舒巴坦敏感的β内酰胺酶检测—杯碟法深圳易瑞抗原抗体法快速检测—试纸条法其他检测方法β内酰胺酶（拮抗剂）的检测方法β内酰胺酶（拮抗剂）的检测方法舒巴坦敏感的β内酰胺酶检测—杯碟法

本检测方法为间接法，用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株藤黄微球菌作为指示菌，利用舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性间接测定样品是否含有β-内酰胺酶类药物。在参照杯（本方法中的C和D杯)能证明加入的舒巴坦有活性的前提下比较判定杯(本方法中的A和B杯)抑菌圈直径，如果抑菌圈直径相差<3mm，即两杯中的抗生素均未被分解，证明样品中无β-内酰胺酶残留；如果抑菌圈直径相差≥3mm，即未加舒巴坦的A杯中抗生素被分解，而加入舒巴坦的B杯中抗生素未被分解，证明样品中有β-内酰胺酶残留。本方法的检出限为0.5U/ml本方法单样检测时间为24小时。

————以上内容参考蒙牛乳业《β-内酰胺酶类药物检测作业指导书》P.7β内酰胺酶（拮抗剂）的检测方法β内酰胺酶（拮抗剂）的检测方法深圳易瑞抗原抗体法快速检测—试纸条法

本检测方法亦为间接法，利用β-内酰胺酶在原奶中强大的降解β内酰胺类抗生素的能力，人为向原奶中添加一定浓度的β内酰胺类抗生素，经过一定时间的温育反应后用易瑞抗原抗体反应体系检测β内酰胺类残留，如果原奶中β类抗生素为阳性(+)，即添加的β类抗生素未被分解掉，证明原奶中无β-内酰胺酶残留；如果原奶中抗生素为阴性(-)，即添加的抗生素被分解掉，证明原奶中有β-内酰胺酶残留。本方法的检出限：0.25-0.5U（31min）、0.75-1.5U（22min）以及2-3U（15min）；本方法的检测时间为15-31分钟不等本方法31分钟检出限与杯碟法非常吻合（据江苏省质检院验证）β内酰胺酶（拮抗剂）的检测方法β内酰胺酶（拮抗剂）的检测方法其他检测方法

其他检测方法如碘量法以及E50抗生素间接法等，包括进口

Snap，Charm相关检测方法对于β内酰胺酶的检出限均在4U或以

上，且检测时间在40分钟-2小时不等。深圳易瑞β内酰胺酶产品操作培训深圳易瑞β内酰胺酶产品操作培训-检测方法：第一步：温育器温度自动跳至40℃，待其稳定；第二步：首先取出白色反应微孔，加入200ul待测样品，吸打混匀；

第三步：白色微孔混匀后放在加热器上孵育25分钟（检出限约0.5U，与杯碟法真实检出限基本一致）：

注意：孵育16分钟，检出限为0.75-1.5U孵育9分钟，检出限为2-3U

牛乳中β内酰胺酶快速检测试纸条操作演示深圳易瑞β内酰胺酶产品操作培训-检测方法：第四步：从加热器上取下白色微孔，将白色微孔中的溶液完全转入到红色微孔，在红色微孔混匀后，完全吸取并转回至原白色微孔中，再次混匀；并重新放回至加热器；第五步：在加热器上孵育3分钟：牛乳中β内酰胺酶快速检测试纸条操作演示深圳易瑞β内酰胺酶产品操作培训-检测方法：第六步：3分钟孵育时间到后，插入β内酰胺酶试纸条，试纸条孵育3分钟后肉眼读取结果或者读数仪判定结果：读数仪判定：读数值<0.9为阴性读数值>0.9为阳性（读数必须在实验结束3分钟内读取有效）注意：1.待检样大于3个时请用排枪进行转移以及混匀操作；2.白色微孔所含为β类抗生素，与待检样内的β酶竞争从而通过消耗掉的抗生素来判断β酶的含量，故白色孔两步转回目的是减少人为消耗β类抗生素而造成假阳性。牧场β内酰胺酶的建议管控方法牧场β内酰胺酶的建议管控方法停止使用“拮抗剂”清洗奶罐等设备；从牧场源头依据每头牛的用药记录找出2次以上使用过β内酰胺类抗生素药物的奶牛，暂停其正常供奶，并用易瑞试纸条对该牛的鲜奶进行监测：刚挤出的鲜奶检测结果为阴性的牛奶2-8℃保存12小时后充分混匀并再次检测，结果为阴性的用药牛暂无耐药菌，结果为阳性的用药牛已经产生耐药菌，在体外能够大量代谢β内酰胺酶使得整个储奶罐变为阳性（依据：1个产超广谱β内酶胺酶耐药菌株在生鲜牛乳体外培养过程中能够产生内源性β-内酰胺酶的活力50~85U/ml）；对阳性牛采取治疗（具体方法咨询兽医或者电联易瑞工程师）；对该牧场已使用过的β内酰胺类药物的牛采取轮换用药的形式避免细菌耐药性的产生（或采取抗生素协同抑制剂药物进行乳房炎疾病的治疗等）；区分内源性与外源性β内酰胺酶的方法区分内源性与外源性β内酰胺酶的方法：阳性样品倍比稀释获得临界阴性奶样并体外细菌培养法；阳性样品离心法获得耐药菌群添加实验鉴别法（详