《食用油中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析法》 编制说明

2《食用油中黄曲霉毒素B1的测定时间分辨荧光免疫层析法》编制说明主编单位和参编单位、人员及分工等。黄曲霉毒素B1是由黄曲霉和寄生曲霉等菌株产生的有毒次生代谢产物，具有致植物油加工店花生油黄曲霉毒素B1超标；2019年，国家市场监管总局抽查出“熊八妹-串联质谱法、酶联免疫吸筛查法与放射免疫法等。薄层色谱法曾是使用最广泛的分析方法，但是由于操作步骤繁琐，毒性大，现在已经很少使用。高效液相色谱-串联质谱3制定《食用油中黄曲霉毒素B1的测定从上世纪90年代，我国逐渐建立了多种食用油黄曲霉毒素测定技术，这些技术为能适应中国食用油现代化安全生产准确度高、操作简单的测定要求。我国相关标准有法都需要大型仪器，无法满足现场快速检测需求；LS/T6122-2017《粮油检验粮油及制品中黄曲霉毒素含量测定柱后光化学衍生高效液相色谱法》需要高效液相色谱仪成前期工作，提案和立项。2023年5月-2023年12月，由中国农业科学院油料作物4李培武，中国农业科学院油料作物研究所，研究华权高，武汉华美维士康生物工程有限公司，董二、标准编制原则和确定标准的主要内容(如技术指标、参数公式、性能、要求、5试样中黄曲霉毒素B1与铕乳胶标记的特异2前处理条件的优化表1食用植物油取样量对样品检测结样品取样量检测结果，µg/kg平均值µg/kgRSD%12345花生油0.239.0027.0022.0520.8525.6231.330.528.5030.1520.5525.2027.4526.3725.3521.1520.2521.1523.7022.329.532.023.8521.0022.9521.369.315.020.409.28大豆油0.26.469.078.949.348.970.58.029.809.619.349.609.569.849.309.336.272.09.359.968.535.09.359.76菜籽油0.25.605.058.205.804.755.8823.180.54.305.456.404.805.655.326.455.906.205.455.705.946.672.04.995.575.685.686.265.648.015.05.805.685.344.936.095.578.022.2提取溶剂选择和用量6主要是与装有反向离子交换吸附剂的多功能净化柱联用；考虑到检测方法的适用性和与相关标准检测结果的可比性，选样品80%乙醇溶液用量0.4mL0.6mL2.0mL3.0mL含量µg/kgRSD%含量µg/kgRSD%含量µg/kgRSD%含量µg/kgRSD%含量µg/kgRSD%花生油24.121.88.222.521.57.9大豆油6.520.18.99.88.68.08.2菜籽油3.222.74.85.25.49.45.39.5从表4可看出，提取花生油、大豆油和菜籽油样品，随着乙醇溶液用量增大，提取越完全，乙醇溶液超过1.0mL后检测结果无显著差异，考虑绿色环保及节约试剂，因此，选择1.0mL的80%乙醇溶液作为提取溶剂。2.3提取方式、时间选择表3不同提取方式、不同提取时间条件下提取效果比较提取方式提取时间样品（加标浓度µg/kg）花生油大豆油菜籽油7旋涡提取方式(测试回收率%)90.495.886.22min86.492.193.15min94.688.593.892.194.820min89.584.994.1振摇提取方式(测试回收率%)85.299.32min92.093.55min93.293.395.486.694.220min88.184.5超声波提取方式(测试回收率%)75.974.482.22min83.674.283.55min78.284.984.485.395.492.620min92.390.694.13免疫层析反应温度对实验的影响体反应。样品中的黄曲霉毒B1在与铕标记的特应的重要因素。抗原抗体反应一般在15℃~40℃范围内进行，在此范围内，温度越高，曲霉毒B1现场筛查检测技术，保证反应温度的4免疫层析反应时间对实验的影响8样品名称反应时间2min3min5min10min含量µg/kgRSD%含量µg/kgRSD%含量µg/kgRSD%含量µg/kgRSD%含量µg/kgRSD%花生油22.222.69.322.18.7大豆油6.68.99.08.88.0菜籽油3.54.85.75.89.25.3纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细作用，滴加在样品反应瓶中的液体溶解了铕-抗标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素（NC）膜检测线上黄曲霉毒B1-BSA偶联物的结合，使检测线荧光强度降低，从而样品中黄曲霉毒素浓度与检测线X=pVnm9p——从标准曲线上查得的测定液中黄曲霉毒素含量，单位为纳克每毫升的样本。由低浓度到高浓度进行检测，根据检测线T信号值与质控线C信号值的比值（T/C）和标准工作溶液浓度的自然对数值（I线的荧光信号强度值/C线的荧光信号强度值（T/C）绘制标准曲线，线性回归方程为：根据GB/T5009.1－2003（附录A检验方法中技术参数和数据处理检出限计LX1s Xi－测定n次空白溶液的平均值（n≥20b－单位标准溶液峰面积响应值；标准起草小组分别对花生油、大豆油、菜籽油空白样品进行了21次重复实验，用大豆油、菜籽油的黄曲霉毒素B1进行平行测定实验，测定结果见表5。结果表明两种样品免疫亲和层析净化高效液相色谱法µg/kg时间分辨荧光免疫层析法µg/kg时间分辨荧光免疫层析法RSD%绝对差µg/kg花生油22.221.98.50.3大豆油7.60.6菜籽油6.45.67.10.8标准起草小组在同一时间对花生油、大豆油、菜籽油样品分别进行了11次重复测μg/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%；黄曲霉毒B1含样品名称黄曲霉毒素B1含量，µg/kg123456789平均值相对相差%花生油21.822.121.020.320.620.221.520.622.520.321.1大豆油9.59.69.29.89.59.49.09.49.98菜籽油5.45.35.54.85.65.55.25.85.75.75.65.3样品名称黄曲霉毒素B1含量，μg/kg2023年09月13日2023年10月20日2023年11月30日平均值相对相差%花生油24.423.125.9大豆油菜籽油5.26.4B1测定的再现性要求。由此确定本标准再现性要求为：在重复性条件下，黄曲霉毒素B1含量不大于10.0μg/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的30%；黄曲霉毒B1含量大于10.0μg/kg时，两次独立测定结果的绝对差值不得超过算对4个食用油样品中黄曲霉毒素B1进行了比对检测，检测结果汇总见表8；对结果统表8食用油中黄曲霉毒素实验室间比对检测结果单位样品重复1重复2重复3重复4重复5平均值变异系数%实验室124.425.023.025.320.223.68.82号油样9.88.49.67.23号油样8.74号油样NDNDNDNDND--实验室223.323.822.024.222.58.82号油样9.46.99.78.93号油样4号油样NDNDNDNDND--实验室325.626.224.226.621.624.82号油样8.97.69.93号油样8.74号油样NDNDNDNDND--实验室425.324.923.824.920.924.07.52号油样8.77.59.63号油样7.64号油样NDNDNDNDND--表9食用油中黄曲霉毒素实验室间比对检测结果统计分析