肝脏蛋白的提取和浓度测定

肝脏蛋白的提取和浓度测定第1页，课件共18页，创作于2023年2月实验目的了解并掌握蛋白质的提取方法了解掌握考马斯亮蓝法（Braford法）测定蛋白质含量的原理和方法第2页，课件共18页，创作于2023年2月实验内容实验目的◆肝脏组织蛋白的提取◆蛋白的浓度测定第3页，课件共18页，创作于2023年2月

原理：

RIPA裂解液是一种传统的细胞组织快速裂解液，主要裂解成分含1%TritonX-100,0.5%胆氧胆酸钠（sodiumdeoxycholate）,0.1%SDS，得到的蛋白样品可以用于常规的Western。1.肝脏组织的提取第4页，课件共18页，创作于2023年2月操作步骤超声匀浆冰上放置4度离心吸取上清1.肝脏组织的提取组织取材第5页，课件共18页，创作于2023年2月1.肝脏组织的提取

（1）组织取材：

取约100mg大鼠肝脏组织，用灭菌的剪刀将组织块尽量剪碎，放入1.5ml灭菌的EP管中

第6页，课件共18页，创作于2023年2月1.肝脏组织的提取

（2）超声匀浆：

加0.5mlRIPA裂解液（含50ulPMSF）,置于冰上，用超声匀浆器进行匀浆,超声每次10秒，重复3次第7页，课件共18页，创作于2023年2月1.肝脏组织的提取

（3）冰上放置：

裂解完全后，冰上放置30分钟第8页，课件共18页，创作于2023年2月1.肝脏组织的提取

（4）4度离心：

放入离心机中，4℃12000rpm离心5min

第9页，课件共18页，创作于2023年2月1.肝脏组织的提取

（5）吸取上清：

取上清分装于0.2ml离心管中并置于－20℃保存，待用第10页，课件共18页，创作于2023年2月超声匀浆要保持低温超声强度以不产生泡沫为准注意事项第11页，课件共18页，创作于2023年2月2.蛋白的浓度测定考马斯亮蓝法BCA法紫外吸收法Lowry法(Folin-酚试剂法)双缩脲法第12页，课件共18页，创作于2023年2月第13页，课件共18页，创作于2023年2月2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。在595nm下，光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。第14页，课件共18页，创作于2023年2月15实验步骤空白管标准管测定管

01234561mg/mL牛血清白蛋白溶液蒸馏水待测样品考马斯亮蓝G25000.20.40.60.81.001.00.80.60.40.200––––––15555555管号试剂(ml)1.取试管7支，编号，按下表加入试剂:2.

混匀,

室温放置2min。在波长

595nm

处以0号管调零，测定各管吸光度值。第15页，课件共18页，创作于2023年2月16

以标准液的蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。C（蛋白浓度）A（吸光度）Axcx

绘制标准曲线：0.20.40.60.81.0mg/mLOD第16页，课件共18页，创作于2023年2月实验内容◆肾