Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统介导重组腺相关病毒的制备的综述报告

Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统介导重组腺相关病毒的制备的综述报告Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统是目前广泛应用于昆虫细胞的表达系统之一。这个系统利用了杆状病毒的DNA逆转录酶，将外源原核或真核基因插入到病毒基因组中，然后利用病毒的自我复制和自我组装功能，从而实现外源基因在昆虫细胞内的表达。而在这个系统中，重组腺相关病毒（rAd）是其中的一种表达载体。本文将综述Bac-to-Bac系统在制备rAd中的应用及其制备过程。一、重组腺相关病毒简介腺相关病毒（Ad）是一种双链DNA病毒，可以感染多种哺乳动物细胞，并在宿主细胞中进行繁殖。Ad可以引起人类和动物的许多疾病，因此被广泛应用于基因治疗，基因表达和疫苗制备等方面。重组腺相关病毒（rAd）是通过将外源基因插入Ad基因组中来制备的。这个过程可以通过几种不同的方法实现，其中包括Cre-loxP、FRT-flp、RMCE和LR等。rAd载体也分为两种类型，即第一代和第二代。第一代rAd是将外源基因插入到AdE1或E3区域中，因此它们不能完全复制和包装，限制了它们在基因治疗和大规模生产中的应用。而第二代rAd则是通过删除E1或E3区域，来构建基因组无法复制和包装的病毒，从而提高其表达效率和生产能力。在本文中，我们将针对第二代rAd进行制备介绍。二、Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统介绍Bac-to-Bac系统是一种基于细菌系统的表达系统，利用了大肠杆菌（E.coli）中的转座子Tn7与昆虫体内杆状病毒的复制和表达能力。该系统的优点是可以高效地生产表达所需蛋白的杆状病毒，在可以产生蛋白的体外表达系统中，具有优异的产量和纯度。Bac-to-Bac系统的制备过程分为以下几步：首先，将外源基因（如rAd）插入到杆状病毒背景中，形成杆状病毒完整基因组。然后，将该基因组转化到E.coli中，选择背景和rAd基因组之间的相互重组，得到含有rAd完整基因组的杆状病毒质粒。接下来，将该质粒转染到昆虫肝细胞（Sf9或Sf21），进行病毒的自我复制和自我组装，得到高效的外源基因表达。三、制备重组腺相关病毒过程在制备rAd的过程中，需要先构建一个含有rAd外源基因的Bac-to-Bac背景质粒。该质粒含有杆状病毒的完整基因组，但缺少了杆状病毒内部重复序列（ITRs）以及E1/E3表达区域，从而形成无剪接缺陷和无重复序列的“空白”背景。将rAd插入到“空白”背景中，需要通过重组技术实现。这一步骤可以在体内或体外进行。体外方法可以利用Cre重组酶，在重组酶存在下，rAd与背景质粒DNA重组，形成可以重构为病毒颗粒的质粒。然而，体内方法则使用载体，该载体编码Cre重组酶，同时还包括两个位点，以利于rAd和背景质粒DNA的重组。这需要在重组酶的存在下，在感染了背景质粒DNA的细胞内，将rAd载体DNA转染到细胞中。在获得rAd载体产生的体内或体外重组背景质粒之后，接下来的制备过程就和常规Bac-to-Bac系统的操作相同。将带有rAd背景质粒的E.coli质粒，通过热激转化的方式导入Sf9或Sf21细胞中。利用病毒的自我复制和自我组装运转机制，rAd可以在昆虫细胞中的高效表达。四、结论总之，Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统是一种有效的表达系统，可以高效地表达外源基因。结合重组技术，该系统可用于重