SNT 1692.2-2006非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程forAfricanhorsesickness2006-01-26发布国家质量监督检验检疫总局I—-非洲马瘟琼脂免疫扩散试验操作规程；——非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程；——非洲马瘟补体结合试验操作规程。本部分为SN/T1692的第2部分。本部分的附录A为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程SN/T1692的本部分规定了非洲马瘟血凝和血凝抑制试验的方法。本部分适用于马属动物非洲马瘟的检疫、疫情监测和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1692的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3试剂和材料3.1试剂纯度除另有说明外，所有的化学试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682的要求。3.2生理盐水的配制配制方法见附录A。3.3pH9.0硼酸盐缓冲液(BS)配制方法见附录A。3.4磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法见附录A。3.5红细胞保存液配制方法见附录A。3.6红细胞稀释液配制方法见附录A。3.70.3%红细胞悬液和1%红细胞悬液配制方法见附录A。3.825%白陶土溶液配制方法见附录A。3.9标准试剂3.9.1非洲马瘟血凝素，由指定单位提供。3.9.2非洲马瘟阳性血清，由指定单位提供。3.9.3非洲马瘟阴性血清，由指定单位提供。架盘天平、分析天平、离心机、96孔V型微量血凝板、微型振荡器、10mL真空采血管、3.11试验动物健康青年马(1岁～2岁)。2弃去弃去无菌采取被检动物血液10mL,待血液凝固后，以2000r/min离心10min,分离血清，血清4℃保存备用。若需长期保存，则置于-20℃。被检血清和吸附剂(pH9.0硼酸盐缓冲液和25%白陶土溶液按4:5混合)按1:1混合后，在室温下充分振荡30min,再经56℃灭活30min,然后2500r/min离心30min,取上清加入1倍体积的1%健康马红细胞生理盐水悬液，摇匀后在室温下静止30min,再经1000r/min离心15min,取上清，即为1:4试验血清。5操作方法5.1.1血球凝集试验见表1。孔号123456789血凝素稀释度对照生理盐水/μL25血凝素/μLBS缓冲液/μL0.3%红细胞悬液/μL感作室温(22℃~25℃)中静置1h左右判定十十十++++一十十-十十十十十+——注：+十+十表示红细胞已100%凝集，呈一层薄膜状，凝集颗粒均匀分布于整个孔底；+++表示红细胞约75%凝集，但孔底仍有红细胞沉淀成滴状，周围已形成膜状；++表示红细胞约50%凝集，血滴周围有凝集颗粒，但不呈膜状；+表示红细胞约25%凝集，血滴周围仅有少量的凝集颗粒；一表示红细胞0%凝集，呈圆滴状沉淀于孔底，周围无凝集颗粒。充分混匀后吸25μL至第二孔作等量倍比稀释至倒数第二孔，并从倒数第二孔中吸去25μL。最后一孔不加血凝素作为红细胞对照。5.1.3每孔加BS缓冲液25μL,在微型振荡器上充分摇匀，室温(22℃~25℃)放置45min。5.1.4每孔加入0.3%红细胞悬液50μL,在微型振荡器上充分摇匀后，室温放置1h,判断结果。5.1.5血凝素单位的标定5.1.5.1能与红细胞凝集成“++++”的最高稀释度定为血凝素的1个单位(HAU),表1中的血凝素单位为1:28。5.1.5.2在血凝抑制试验中，所用的血凝素单位要求在25μL中含4个HAU,即1:32。3弃弃5.2.5室温下静置45min。5.2.6每孔加入0.3%红细胞悬液50μL,在微型振荡器上充分摇匀，室温中静置1h左右，待对照红孔号23456789血清稀释度对照BS缓冲液/μL血清/μL4个HAU血凝素/μL室温(22℃~25℃)下静置45min0.3%红细胞悬液/μl感作室温(22℃~25℃)中静置1h左右判定十十十十++++++4十中一十十++5.3.1红细胞均匀分散在孔底周围、倾斜血凝板时不流淌判为100%凝集，记作++++;75%凝集记淌，100%凝集，即+十十十；红细胞对照孔的红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时流淌，不5.3.3能完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释度判为该血清的血凝抑制效价，5.3.4非洲马瘟血球凝集试验阳性标准：血清的血凝抑制效价大于等于1:8者为阳性。如表2中血清效价为1:16。4(规范性附录)试剂配制A.1生理盐水的配制称8.5g氯化钠(NaCl)加去离子水溶解后，定容至1000mL,分装，112kPa高压灭菌20min,4℃A.2.10.5mol/L的硼酸溶液硼酸(H₃BO₃)A.2.21.0mol/L氢氧化钠溶液加去离子水溶解后.定容至1000mL,室温静止3d后使用。加去离子水溶解后，定容至1000mL,112kPa高压灭菌20min,4℃保存备用。取0.5mol/L硼酸溶液100mL、1.0mol/L氢氧化钠溶液24mL、1.5mol/L.氯化钠溶液80mL加去离子水定容至1000mL,混匀即成pH9.0硼酸盐缓冲液，4℃保存备用。NaClNa₃C₆H₃O₇·2H₂OH₃C₅H;O,·2H₂OC₆H₁₂O₆·2H₂O加去离子水分别溶解后，定容至1000mL。分装，112kPa高压灭菌20min,置4℃保存备用。A.4磷酸盐缓冲液(PBS)的配制磷酸氢二钠(Na₂HPO.·12H₂O)35.81g加去离子水定容至500mL,112kPa高压灭菌20min,置4℃保存备用。磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)加去离子水定容至500mL,112kPa高压灭菌20min,置4℃保存备用。A.4.3pH6.4磷酸盐缓冲液(PBS)取甲液32mL和乙液68mL混合，配制成pH6.4磷酸盐缓冲液(PBS),置4℃保存备用。5A.5红细胞稀释液的配制A.7.10.1