2021新高考生物选择性考试B方案一轮复习学案第10单元第35讲基因工程（含多聚酶链式反应扩增DNA片段）

选修3现代生物科技专题第十单元现代生物科技专题第35讲基因工程(含多聚酶链式反应扩增DNA片段)[考纲明细]1.基因工程的诞生(Ⅰ)2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)3.基因工程的应用(Ⅱ)4.蛋白质工程(Ⅰ)5.实验：DNA的粗提取与鉴定知识自主梳理一基因工程的概念及基本工具1．基因工程概念基因工程的别名基因拼接技术或eq\x(\s\up1(01))DNA重组技术操作环境生物体外操作对象eq\x(\s\up1(02))基因操作原理eq\x(\s\up1(03))基因重组操作水平eq\x(\s\up1(04))DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达目的创造出更符合人们需要的eq\x(\s\up1(05))生物类型和生物产品优点克服远缘杂交不亲和障碍，eq\x(\s\up1(06))定向改造生物的遗传性状2．DNA重组技术的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称：eq\x(\s\up1(07))限制酶)①本质：蛋白质。②来源：主要是从eq\x(\s\up1(08))原核生物中分离纯化出来的。③作用：识别双链DNA分子的某种特定的eq\x(\s\up1(09))核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的eq\x(\s\up1(10))磷酸二酯键断开。④结果：产生eq\x(\s\up1(11))黏性末端或eq\x(\s\up1(12))平末端。例：如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是eq\x(\s\up1(13))—GAATTC—，切割位点在eq\x(\s\up1(14))G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是eq\x(\s\up1(15))—CCCGGG—，切割位点在eq\x(\s\up1(16))C和G之间；说明限制酶具有eq\x(\s\up1(17))特异性。限制酶为何不切割自身DNA?提示限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是自身DNA中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)DNA连接酶①作用：将限制酶切割下来的DNA片段eq\x(\s\up1(20))拼接成新的DNA分子。②类型常用类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源eq\x(\s\up1(21))大肠杆菌T4噬菌体功能只“缝合”eq\x(\s\up1(22))黏性末端“缝合”eq\x(\s\up1(23))黏性末端和平末端结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的eq\x(\s\up1(24))磷酸二酯键③DNA连接酶和限制酶的关系(3)载体①载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。②常用载体：eq\x(\s\up1(25))质粒。其他载体：λ噬菌体衍生物、eq\x(\s\up1(26))动植物病毒等。③质粒a．概念：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌eq\x(\s\up1(27))拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链eq\x(\s\up1(28))环状DNA分子。b．特点：能自我复制；有一个至多个eq\x(\s\up1(29))限制酶切割位点；有特殊eq\x(\s\up1(30))标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。二基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取目的基因：主要指eq\x(\s\up1(01))编码蛋白质的基因，也可以是一些具eq\x(\s\up1(02))调控作用的因子。获取方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(从\x(\s\up1(03))基因文库中获取,人工合成\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(利用\x(\s\up1(04))mRNA反转录合成,通过\x(\s\up1(05))DNA合成仪用化学方法人工合成)),利用PCR技术扩增))(1)从基因文库中获取①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多eq\x(\s\up1(06))DNA片段，导入eq\x(\s\up1(07))受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，可分为eq\x(\s\up1(08))基因组文库和eq\x(\s\up1(09))部分基因文库(如cDNA文库)。②构建过程基因组文库的构建cDNA文库的构建(2)利用PCR技术扩增目的基因①基础知识PCR含义是一项在生物体外eq\x(\s\up1(17))复制特定DNA片段的核酸合成技术PCR原理DNAeq\x(\s\up1(18))双链复制续表前提条件有一段已知目的基因的eq\x(\s\up1(19))核苷酸序列，以便根据这一序列合成eq\x(\s\up1(20))引物要求模板eq\x(\s\up1(21))目的基因两条链原料dCTP、dATP、dGTP、dTTP酶热稳定eq\x(\s\up1(22))DNA聚合酶(eq\x(\s\up1(23))Taq酶)引物人工合成的两条eq\x(\s\up1(24))DNA片段(引物1，引物2)PCR反应过程变性当温度上升到eq\x(\s\up1(25))90～95_℃时，双链DNA解旋为单链复性温度下降到eq\x(\s\up1(26))55～60_℃时，两种引物通过eq\x(\s\up1(27))碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸70～75℃时，eq\x(\s\up1(28))Taq酶从引物3′端开始进行互补链的合成扩增方向DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的eq\x(\s\up1(29))5′端向3′端延伸方式指数形式扩增(2n，n为扩增循环的次数)结果eq\x(\s\up1(30))短时间内大量扩增目的基因②PCR反应的实验操作实验用具a.PCR仪b.eq\x(\s\up1(32))微量离心管：一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL。c.eq\x(\s\up1(33))微量移液器：用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。续表操作步骤准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上↓移液：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分↓混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁↓离心：将eq\x(\s\up1(34))微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是使反应液集中在离心管eq\x(\s\up1(35))底部↓反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应DNA含量测定DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与eq\x(\s\up1(36))DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：稀释：取2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，将样品进行eq\x(\s\up1(37))50倍稀释↓对照调零：以eq\x(\s\up1(38))蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至eq\x(\s\up1(39))零↓测定：取DNA稀释液100μL至eq\x(\s\up1(40))比色杯中，测定260nm处的光吸收值↓计算：DNA含量(μg/mL)＝50*×(260nm的读数)×稀释倍数注：公式中50的含义：在标准厚度为1cm的比色杯中，OD260为1相当于50μg/mL的双链DNA注意事项a.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸液枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必需进行eq\x(\s\up1(41))高压灭菌b．PCR所用的缓冲液实验前应分装成小份，并在eq\x(\s\up1(42))－20_℃储存。使用前，将缓冲液从冰箱中取出，放在冰块上缓慢融化，备用c．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后移液器上的枪头必须更换d．混匀后离心处理，使反应液集中在eq\x(\s\up1(43))离心管底部(3)人工合成①前提条件：核苷酸序列eq\x(\s\up1(44))已知，基因eq\x(\s\up1(45))比较小。②方法a．反转录法：目的基因的mRNAeq\o(→,\s\up17(反转录))eq\x(\s\up1(46))单链DNA→双链DNA(目的基因)b．化学合成法：通过DNA合成仪直接人工合成2．基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)操作目的使目的基因在受体细胞中eq\x(\s\up1(47))稳定存在，并且可以eq\x(\s\up1(48))遗传给下一代，同时，使目的基因能够eq\x(\s\up1(49))表达和发挥作用。(2)组成(3)构建过程获取目的基因与切割载体时只能用同一种限制酶吗？提示不是只能用一种限制酶，也可以用不同的限制酶，只要切割后目的基因和载体的黏性末端相同即可。3．将目的基因导入受体细胞(1)将目的基因导入植物细胞①eq\x(\s\up1(63))农杆菌转化法：最常用的方法。a．受体细胞：植物eq\x(\s\up1(64))体细胞或受精卵。b．操作过程：将目的基因插入eq\x(\s\up1(65))Ti质粒的T­DNA上→转入eq\x(\s\up1(66))农杆菌→导入eq\x(\s\up1(67))植物细胞→T­DNA上的目的基因整合到eq\x(\s\up1(68))受体细胞的染色体DNA上→目的基因表达。②基因枪法：适用于eq\x(\s\up1(69))单子叶植物，成本较高。③花粉管通道法：将目的基因通过eq\x(\s\up1(70))花粉管通道导入受体细胞，十分简便经济。(2)将目的基因导入动物细胞①方法：eq\x(\s\up1(71))显微注射技术。②受体细胞：动物的eq\x(\s\up1(72))受精卵。③操作过程：将含有eq\x(\s\up1(73))目的基因的表达载体提纯→取卵(eq\x(\s\up1(74))受精卵)→eq\x(\s\up1(75))显微注射→受精卵经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的eq\x(\s\up1(76))输卵管或子宫内→获得具有eq\x(\s\up1(77))新性状的动物。获得转基因动物时，通常选择受精卵做受体细胞的原因？提示受精卵全能性高，可使目的基因在相应的组织细胞内表达。(3)将目的基因导入微生物细胞①转化方法a．用eq\x(\s\up1(78))Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为eq\x(\s\up1(79))感受态细胞)。b．感受态细胞吸收eq\x(\s\up1(80))重组表达载体DNA分子。②受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、eq\x(\s\up1(81))遗传物质相对较少等。4．目的基因的检测与鉴定类型步骤检测内容方法分子检测第一步转基因生物的DNA上是否插入了目的基因eq\x(\s\up1(82))DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)第二步目的基因是否转录出了mRNAeq\x(\s\up1(83))分子杂交技术(DNA和mRNA之间)第三步目的基因是否翻译成蛋白质eq\x(\s\up1(84))抗原—抗体杂交技术个体生物学水平鉴定抗虫或抗病接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度(1)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在eq\x(\s\up1(85))体外进行的。(2)在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是用eq\x(\s\up1(86))放射性同位素等作标记的含有eq\x(\s\up1(87))目的基因的DNA片段。三基因工程的应用1．转基因植物植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、eq\x(\s\up1(01))抗干旱和抗盐碱等)，以及改良eq\x(\s\up1(02))农作物的品质和利用植物eq\x(\s\up1(03))生产药物等方面。2．转基因动物动物基因工程在动物品种改良、建立eq\x(\s\up1(04))生物反应器、器官移植等方面显示了广阔的应用前景。3．基因工程药物(1)来源：转基因的eq\x(\s\up1(05))工程菌。(2)成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。(3)作用：用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、eq\x(\s\up1(06))遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。4．基因治疗(1)方法：把eq\x(\s\up1(07))正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能。(2)效果：治疗eq\x(\s\up1(08))遗传病的最有效的手段。(3)分类：eq\x(\s\up1(09))体内基因治疗和体外基因治疗。四蛋白质工程1．概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过eq\x(\s\up1(01))基因修饰或eq\x(\s\up1(02))基因合成，对现有蛋白质进行eq\x(\s\up1(03))改造，或制造一种eq\x(\s\up1(04))新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。2．基本途径：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测应有的eq\x(\s\up1(05))氨基酸序列→找到对应的eq\x(\s\up1(06))脱氧核苷酸序列(基因)。考点题型突破考点1基因工程的操作工具1．下列关于载体的相关叙述错误的是()A．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒B．天然质粒均可以直接用作载体将目的基因送入受体细胞C．载体DNA分子上要有一个至多个限制酶切割位点D．载体上的标记基因有利用筛选含重组DNA的细胞答案B解析天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造。2．(2016·全国卷Ⅲ)图a中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图b为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是___________________________________________________。(2)若某人利用图b所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图c所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是___________________________________________。(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________________。答案(1)Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可)(3)E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶(其他合理答案也可)解析(1)分析图a可知，限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能被转录。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。与DNA相关的六种酶的比较名称作用部位底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸以单链DNA为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸以DNA一条链为模板，将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端考点2基因工程的基本操作程序1．使用PCR仪具体实验操作顺序应为()①设计好PCR仪的循环程序②按配方准备好各组分③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分④进行PCR反应⑤离心使反应液集中在离心管底部A．②③⑤④① B．①⑤③②④C．②③⑤①④ D．④②⑤③①答案C解析PCR反应的操作步骤一般分为准备—移液—混合—离心—反应。因PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。2．PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将()A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链延伸D．无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链答案B解析当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物固定端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA子链。3．(2019·成都一诊)用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示。回答下列问题：(1)①过程所需的酶是________。从cDNA文库中获取的目的基因________(填“有”或“无”)启动子。实现②过程常用________技术，运用该技术的前提是要有________________________，以便合成引物。(2)过程③将重组表达载体导入大肠杆菌时，首先用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是____________________________。然后将________________溶于缓冲液中与该大肠杆菌混合，在一定温度下完成转化。(3)过程④可利用________技术鉴定CarE基因是否已导入大肠杆菌。答案(1)逆转录酶无PCR一段已知目的基因的核苷酸序列(2)使大肠杆菌处于较易吸收周围环境中DNA分子的生理状态重组表达载体(重组质粒)(3)DNA分子杂交解析(1)过程①是以mRNA为模板合成cDNA的逆转录(反转录)过程，此过程需要逆转录酶的参与。mRNA中无启动子的转录片段，所以从cDNA文库中获取的目的基因无启动子。过程②可表示使用PCR技术扩增目的基因的过程，运用该技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。(2)过程③表示将重组表达载体导入大肠杆菌。用Ca2＋处理大肠杆菌的目的是使大肠杆菌处于较易吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体溶于缓冲液中与该大肠杆菌混合，在一定温度下完成转化。(3)过程④是目的基因的检测与鉴定，可利用DNA分子杂交技术鉴定目的基因(即CarE基因)是否导入大肠杆菌。4．(2019·河南省九师联盟高三质检)内皮抑素是从血管内皮细胞瘤中分离出的一种内源性血管生成抑制因子，能特异性地抑制内皮细胞增殖和迁移。某小组为获得内皮抑素，构建分泌型内皮抑素基因表达载体，并在C6细胞(大鼠源性胶质瘤细胞)中表达。具体操作如下：(1)构建分泌型内皮抑素基因表达载体①采用相关技术提取1日龄SD大鼠大脑半球组织中的总RNA，检测RNA质量和浓度。②内皮抑素cDNA的获得：以上述提取的RNA为模板，通过________过程获得cDNA，并利用PCR技术体外扩增cDNA。PCR技术中除需目的基因作为模板外，还需要的条件有____________________________和控制温度等。③为避免目的基因和载体自身环化，酶切目的基因和载体时，可用____________________酶切割，以保证目的基因和载体两侧具有____________________。(2)目的基因在C6细胞中表达(将目的基因导入C6细胞中，并表达)①培养C6细胞时，为防止杂菌污染，同时检测目的基因是否导入受体细胞，可在培养基中加入一定量的________。②若要检测目的基因是否成功整合到受体细胞的DNA上，可采用________________技术。③导入C6细胞中的目的基因成功表达后，可能会使C6细胞在大鼠体内的________________受到抑制。答案(1)②逆转录热稳定DNA聚合酶(Taq酶)、两种引物、四种脱氧核苷酸③两种限制性核酸内切(限制)不同的黏性末端(2)①抗生素②DNA分子杂交③增殖和迁移解析(1)遗传信息从RNA到DNA的过程叫逆转录。PCR技术中除需目的基因作为模板外，还需要的条件有热稳定DNA聚合酶(Taq酶)、两种引物、四种脱氧核苷酸和控制温度等。为避免目的基因和载体自身环化，酶切目的基因和载体时，可用双酶切法，即两种限制性核酸内切(限制)酶切割，以保证目的基因两侧和载体上具有不同的黏性末端。(2)在培养细胞时，为防止杂菌污染，同时检测目的基因是否导入受体细胞，可在培养基中加入一定量的抗生素。若要检测目的基因是否成功整合到受体细胞的DNA上，可采用DNA分子杂交技术。根据题干信息可知，导入C6细胞中的目的基因成功表达后，会使C6细胞在大鼠体内的增殖和迁移受到抑制。1.基因表达载体构建时限制酶的选择(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ、PstⅠ和EcoRⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致(也可以是能形成相同黏性末端的不同限制酶)，以确保具有相同的黏性末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。2．基因表达载体中启动子、终止子的来源(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。3．如何筛选出含有目的基因的受体细胞(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。(3)筛选方法：将转化后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。考点3基因工程的应用及蛋白质工程题型一基因工程的应用1．(2019·福建三明一中高三开学考试)下列实践与基因工程无关的是()A．利用DNA探针检测饮用水是否含病毒B．将一种植物的叶绿体移入另一种植物以提高光合作用效率C．选择“工程菌”来生产胰岛素D．培育转基因抗虫棉答案B解析DNA分子杂交技术是将特定生物的DNA提取出来，用放射性同位素等作标记，以此作为探针检测相应生物的存在，是基因水平的操作，属于基因工程，A错误；将一种植物的叶绿体移入另一种植物以提高光合作用效率这是细胞器水平的操作，是细胞工程，B正确；用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系称为工程菌，C错误；基因工程也叫转基因技术，培育转基因抗虫棉利用了基因工程，D错误。2．普通番茄细胞中含有PG基因，其能控制合成多聚半乳糖醛酸酶(简称PG)，PG能破坏细胞壁使番茄软化不耐贮藏。科学家将抗PG基因导入番茄细胞，培育出了抗软化、保鲜时间长的转基因番茄。如图表示抗PG基因的作用原理，回答下列问题：(1)据图回答该转基因番茄具有抗软化、保鲜时间长的原理是______________________________。(2)为培育抗软化番茄，应采用________技术将抗PG基因进行体外扩增。在该技术的反应体系中除模板、引物、原料外，还需要加入________，这个基因的表达需要________等不可缺少的调控组件。(3)将抗PG基因插入Ti质粒的________上构建基因表达载体，通过农杆菌转化法将抗PG基因导入番茄细胞，为检验抗PG基因是否成功表达，在个体生物学水平上应检测____________________________________。(4)为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，应将抗PG基因导入________(填“细胞核”或“细胞质”)。答案(1)抗PG基因能阻止PG基因表达的翻译过程，使细胞不能合成PG(2)PCR(多聚酶链式反应)热稳定DNA聚合酶(Taq酶)启动子、终止子(3)T－DNA转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短(4)细胞质解析(1)据题图可知，抗PG基因转录成的mRNA能够与PG基因转录成的mRNA结合，阻止了PG基因表达的翻译过程，使细胞不能合成PG，不能破坏细胞壁而使转基因番茄抗软化且保鲜时间延长。(2)采用PCR技术将抗PG基因进行体外扩增；PCR过程所需要的条件有：模板(抗PG基因)、引物、原料、热稳定DNA聚合酶；启动子、终止子等是基因表达不可缺少的调控组件。(3)将抗PG基因插入Ti质粒的T－DNA上构建基因表达载体，通过农杆菌转化法将抗PG基因导入番茄细胞，为检验抗PG基因是否成功表达，在个体生物学水平上应检测转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短。(4)花粉中的雄配子几乎不含质基因，所以为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，应将抗PG基因导入细胞质。有关基因工程应用的四个易错点(1)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。(2)Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。(3)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。(4)并非所有个体都可作为乳腺生物反应器。操作成功的应该是雌性个体，个体本身的繁殖速度较高，泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。题型二蛋白质工程3．(2019·福建三明一中高三开学考试)蛋白质工程的基本流程正确的是()①蛋白质分子结构设计②DNA合成③预期蛋白质功能④根据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列A．①②③④ B．④②①③C．③①④② D．③④①②答案C解析蛋白质工程的基本流程是：③预期蛋白质功能→①预期蛋白质分子结构→④据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列→②合成DNA，C正确。4．(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：________________________________。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__________________和__________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。答案(1)氨基酸序列(或结构)(2)PP1DNA和RNA(或遗传物质)DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列功能解析(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程对构成蛋白质的氨基酸序列进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。所获得的基因表达遵循中心法则，中心法则的全部内容包括DNA和RNA复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即DNA→RNA，RNA→DNA，RNA→蛋白质。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。蛋白质工程与基因工程的比较项目蛋白质工程基因工程区别过程预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相应的脱氧核苷酸序列(基因)获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果生产自然界中没有的蛋白质生产自然界中已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现实验14DNA的粗提取与鉴定1．DNA粗提取和鉴定的原理(1)提取思路：利用DNA和其他物质在理化性质方面的差异，提取DNA。(2)DNA的理化性质(提取和鉴定原理)：①DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同②DNA不溶于酒精；③对酶、高温和洗涤剂的耐受性强；④DNA＋二苯胺试剂eq\o(→,\s\up17(沸水浴))蓝色。2．DNA粗提取和鉴定的操作流程1．(2019·扬州江都中学段考)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是()A．DNA既溶于2mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水B．向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了释放出DNAC．向浓盐溶液中加蒸馏水是为了析出DNAD．用菜花替代鸡血做实验，其实验操作步骤相同答案D解析DNA既溶于2mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水，A正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了让鸡血细胞吸水涨破，从而释放出DNA，B正确；向溶解DNA的浓盐溶液中加蒸馏水是为了降低DNA的溶解度，进而析出DNA，C正确；用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤不完全相同，如植物细胞有细胞壁，破碎细胞时需要加入食盐和洗涤剂并充分搅拌和研磨，D错误。2．下列关于“DNA的粗提取和鉴定”实验依据原理的叙述，错误的是()A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白质能溶于酒精溶液，可将DNA与蛋白质分离B．利用高温能使蛋白质变性，却对DNA没有影响的特性，可将DNA与蛋白质分离C．二苯胺与DNA沸水浴呈现蓝色可用于DNA的鉴定D．在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA与蛋白质分离答案B解析高温能使蛋白质、DNA变性，蛋白质在60～80℃发生变性，DNA在80℃3．下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是()选项试剂操作作用A柠檬酸钠溶液与鸡血混合防止血液凝固B蒸馏水与鸡血细胞混合保持细胞形状C蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中析出蛋白质D冷却的酒精加入到过滤后含DNA的NaCl溶液中产生特定的颜色反应答案A解析蒸馏水与鸡血细胞混合的目的是使红细胞吸水涨破，释放出核物质，B错误；将蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C错误；加入冷却酒精的目的是进一步析出DNA，D错误。DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4加蒸馏水2次①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14mol/L，使DNA析出用纱布过滤4次①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次①加2mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA方向真题体验1．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是____________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是__________________________________________________________________。答案(1)基因组文库cDNA文库(2)解旋酶加热至90～95℃(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活解析(1)基因工程中的基因文库包括基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，通过解旋酶解开DNA双链。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，通过高温(90～95℃(3)大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合酶需耐高温，故在PCR反应中要用能耐高温的Taq酶。2．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是____________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证__________________。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的________________________中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。答案(1)E1和E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核去核卵母细胞(4)核DNA解析(1)甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端而获得的L1－GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶是E1和E4。(2)构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白(GFP)”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。(4)PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。3．(2018·天津高考)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原基因等其他基因分别构建重组质粒，并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起________免疫，增强免疫保护效果。答案(1)PCR多肽(或蛋白质)(2)载体总RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)D(4)细胞解析(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列，则改造后的基因转录合成的mRNA中，终止密码子提前出现，将不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定，以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。(3)由(2)知，转基因宿主细胞含有特殊tRNA基因转录的tRNA，该tRNA的反密码子可与终止密码子配对，并可携带非天然氨基酸(Uaa)，所以培养基中需补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒的基因进行转录时利用的是宿主细胞的酶，识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因该病毒疫苗侵染人体细胞，故可引起细胞免疫。4．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作