多糖分离及结构研究样本

多糖分离纯化基本原则和办法多聚糖(polysaccharide)，简称多糖，常由一百个以上甚至几千个单糖基通过糖苷键连接而成，其性质已大不同于单糖，如甜味和强还原性已经消失，广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物细胞壁中，是构成生命四大基本物质之一，与生命功能维持密切有关。近年来，大量研究表白多糖除了有增强免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用生物学效应外，尚有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用。

1、基本原则

在不破坏多糖活性前提下进行多糖分离纯化。尽量不引入新杂质，或引入新杂质易于除去，如小分子盐类可通过透析作用除去，铵根离子可通过加热挥发除去等[1]。

2、分离纯化办法

多糖生物活性倍受关注，但不少多糖提取办法和工艺尚未成熟，基于效率、成本多方面考虑，各种办法开发、比较、分析是研究工作焦点之一。当前多糖提取办法重要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法。一方面要依照多糖存在形式及提取部位不同，决定在提取之前与否做预解决：提取时需注意对某些含脂较高根、茎、叶、花、果及种子类，在用水提取前，应先加入甲醇或l：l乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂，而对含色素较高根、茎、叶、果实类，需进行脱色解决。

2.1多糖提取与分离办法

由于各类多糖性质及来源不同，因此提取办法也各有所异，重要归纳为如下几类：

第一类

难溶于水，可溶于稀碱液重要是胶类，如木聚糖及半乳糖等。原料粉碎后用0.5mol/L

NaOH水溶液提取，提取液经中和及浓缩等环节，最后加入乙醇，即得粗糖沉淀物。

第二类

易溶于温水，难溶于冷水多糖，可用70~80℃热水提取，提取液用氯仿：正丁醇（4:1）混合除去蛋白质，经透析、浓缩后再加入乙醇即得粗多糖产物[2]。

第三类

粘多糖提取。在组织中，粘多糖与蛋白质以共价键结合，故提取时需设法破坏粘多糖与蛋白质之间结合键。普通使用蛋白酶水解蛋白某些或碱解决，使粘多糖与蛋白质之间结合键断裂，以增进粘多糖释放以便于提取[3]。（1）碱液提取法：本法重要根据是蛋白聚糖糖肽键对碱不稳定。原料经预解决后用0.5mol/LNaOH溶液4℃提取，提取液用酸中和。蛋白质可用调pH、加热、或用白陶土吸附法除去。最后以乙醇沉淀即可获得成品。从软骨中提取软骨素即用此法。（2）蛋白水解酶消化法：从组织中释放出粘多糖办法，经常使用是蛋白水解酶进行消化。普通应用专一性低蛋白酶如木瓜蛋白酶及链霉素以进行广泛蛋白质水解。经酶消化后提取液中重要尚有低分子量得蛋白消化产物及残存蛋白等杂质。蛋白质可用5%三氯醋酸沉淀去除，小分子杂质可用透析法去除。最后加入乙醇可得粘多糖沉淀。2.2多糖除杂质蛋白质去除，通过水提所获得粗多糖常具有较多蛋白质。采用醇沉或其他溶剂沉淀得到粗多糖中常具有较多蛋白质，需要除蛋白。除蛋白办法老式上有sevage法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等。三氯乙酸法去除蛋白率高，但多糖在三氯乙酸中不稳定，糖苷键易断裂，故多糖损失率也较高。鞣酸法蛋白去除率较低，但是此种办法是运用鞣酸与蛋白质特异性反映，不会导致多糖损失。Sevag法蛋白去除率最高,但是由于此法使用试剂是氯仿和正丁醇,而氯仿是有毒物质,容易导致多糖活性下降和溶剂残留。此外，有机溶剂与去蛋白酶结合除蛋白法也常被用在实验研究中，其效率更高，更加节约试剂和资金。为了避免使用有机溶剂可采用重复冻融办法除蛋白。色素去除，植物多糖提取物中具有酚类化合物,在多糖提取过程中由于氧化作用会有色素生成，色素存在会影响多糖色谱分析和性质测定。惯用脱色办法有：吸附法(DE．AE纤维素、硅藻土、活性炭等)、氧化法(过氧化氢)、离子互换法。除小分子杂质，小分子杂质如低聚寡糖残留往往影响多糖生物活性，需要进一步脱除，提高纯度。老式办法是透析法，该法操作简朴、技术成熟，但周期长，往往需要2d-3d，常温下操作有也许导致多糖霉变，必要时需加入少量防腐剂或需在低温条件下进行。随着膜分离技术发展，纤维滤器透析法已经发展起来了，它运用不同孔径膜使大小不同分子分级，这种方式可缩短生产周期，并且条件温和，无疑是多糖脱除杂质一条新途径。2.3多糖纯化办法多糖纯化办法诸多，须依照条件恰当选取。必要时可使用各种办法以达到抱负分离成果1.分级沉淀法用乙醇进行分级分离是分离多糖混合物典型办法，并且合用于大规模分离。该法往往需要多次重复进行才干达到较好效果。如从肝素生产废弃物中分离纯化硫酸皮肤素[4]。分级沉淀有机试剂筛选有机试剂沉淀法作为纯化生物大分子物质一种典型办法，选取有机溶剂时应能和水混溶，使用较多有机溶剂如乙醇、丙醇、丙酮等，为避免生物活性大分子变性失活，沉淀应在低温下进行。分别选用乙醇、丙醇和丙酮作为沉淀剂，取预解决后样品按固液比1∶10溶解于去离子水中，加入0.1V体积沉淀剂，摇匀20min，4℃密封静置24h。离心1r/min，20min，4℃，取出沉淀并用20mL去离子水冲洗、冻干。再向上清液中加入0.1V原溶液体积沉淀剂，重复上述操作，直至加入沉淀剂时持续5次无沉淀产生。取各次沉淀溶解后进行醋酸纤维素薄膜电泳检测。2.季铵盐络合法粘多糖聚阴离子与某些表面活性物质，如十六烷基三甲基溴化铵中季铵基阳离子结合生成季铵络合物。这些络合物在低离子强度水溶液中不溶解。当离子强度增大时，这些络合物可以解离并溶解。本法长处是既合用于实验室又合用于生产。季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，惯用于酸性多糖分离。当溶液pH值增高或加入硼砂缓冲液使糖酸度增高，也会与中性多糖形成沉淀。惯用季铵溴化物(cetyltri．methylammoniumbmmide，cTAB)及其氢氧化物(cetyltmethylamm0niumhydr(Jxiode，CTA一0H)和(certylpyridiumhydroxide，CP一0H)，其浓度普通为1％～10％(W／V)，它们可在酸性、中性、微碱性和碱性中分级沉淀分离出酸性多糖。3.柱层析法3.1凝胶柱层析法：惯用凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)，以不同浓度盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，使各种多糖得以分离纯化，但不适当粘多糖分离。3.2离子互换层析惯用互换剂为DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖凝胶(DEAE—Sephadex)、DEAE-琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose)，此法合用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。最惯用是DEAE-纤维素在pH为6时酸性多糖吸附于互换剂上，中性多糖不吸附，然后用逐渐提高盐浓度洗脱液进行洗脱进而达到分离。它一方面可纯化多糖，另一方面还可分离各种多糖。如川芎多糖分离纯化[5]：纤维素柱水平衡后，取200mg粗多糖样品溶解于蒸馏水中上样，蒸馏水洗脱70ml后，以0～3mol/lNaCl溶液梯度洗脱，流速1.0ml/min，每管收集2ml，硫酸－苯酚法显色检测。凝胶柱层析和离子互换层析往往在分离纯化过程中交替使用，以达到更好分离纯化效果。如灰树花多糖GFP75-2-2B[6]分离：4.超滤法采用中空纤维超滤膜，对多糖去蛋白质后提取液通过超滤去除小分子杂质5.色谱法色谱法是惯用纯化多糖办法，涉及离子互换色谱和凝胶色谱，色谱法是运用填料对不同种类糖吸附作用差别，使混合物中各糖分达到彼此分离办法。逆流色谱（Countercurrentchromatography，CCC）技术是一种无固体载体持续液—液分派色谱技术，其固定相通过重力场和离心力场作用被保存在分离柱内，流动相与固定相在色谱仪内进行分派，而达到物质分离。逆流色谱与老式色谱相比具备无死吸附、进样量大、分离纯度高等明显优势，在食品、生物化工、制药等领域具备辽阔应用前景。在海带多糖[7]分离纯化中使用了该技术。用泵把固定相从进口注入HSCCC分离柱中，待固定相布满后，开动主机，调节转速达到预定转速并稳定后，用20ml固定相溶解0.15g精制多糖，用恒流泵将样品溶液以一定流速注入HSCCC，某些收集器收集。分离完毕后，停止转动。用气泵使HSCCC中液体流出。使用了逆流色谱分离多糖双水相系统，在PEG1000浓度为12%，KH2PO4浓度为8%，K2HPO4浓度为8%，转速在400r/min时，可以使海带多糖达到较好分离。下图为逆流色谱仪示意图。6.制备性区带电泳依照各种多糖分子大小，形状及其所带电荷不同可用电泳法进行分离。7.固定化凝集素亲和层析法近年来依照凝集素能专一地、可逆地与游离和复合糖中单糖和寡糖结合性质，运用固定化凝集素亲和层析作为分离纯化糖蛋白办法。这一办法简朴易行，在温和条件下进行不破坏糖蛋白活性。固定化刀豆凝集素（concanavalinA，ConA）是应用最普遍固定化凝集素。ConA能专一地与甘露糖基结合，各种酶如α-和β-半乳糖苷酶、过氧化氢酶、干扰素等都可用固定化ConA纯化。8.膜分离法膜分离具备无相变及化学变化、可常温操作、选取性高与能耗低等长处。如马尾藻多糖就采用了膜分离纯化技术。海藻多糖是一类构成相称复杂生物大分子，使用膜分离技术对海藻多糖[8]进行分级可达到初步纯化目。在压力0．5MPa，温度20℃条件下，将脱蛋白之后提取液稀释至1L，先用孔径0．1μm微滤膜过滤，提成浓缩液和透过液，将透过液依次用截留分子量为100、50、10、3kD超滤膜进行超滤，分别收集浓缩液和透过液。近20年来，由于分子生物学发展，人们逐渐结识到糖及其复合物分子具备极其重要生物功能，迅速高效、节约能源、简便易行提取与纯化工艺对多糖研究有重要意义。多糖在自然界植物中广泛存在，但由于其种类多样性、构造构成复杂性以及多糖分子量大、极性大等特点，给植物多糖提取、分离带来很大困难，要想获得较高多糖提取率，用单一提取办法不一定能获得抱负效果，将2种或者各种提取办法结合也许得较好提取效果[9]。在多糖分离、纯化中惯用分级沉淀法、纤维素柱色谱法和凝胶色谱法相结合办法进行分离、纯化，使多糖分离、纯化能达到抱负效果。当前较为惯用提取与纯化技术比较成熟，但存在溶剂、能源消耗大且效率不高问题，合理使用某些新技术可以有效改进提取与纯化效果，使多糖制备向高效节能方向发展；不断摸索和完善提取与纯化技术，将会使多糖制备向绿色、当代化方向发展。多糖提取分离纯化办法在不断更新，在选用办法时，应当关注目的多糖性质、特点，综合比较进行实验，才干选用最佳办法和工艺。参照文献[1]YuanfengWang,LanYu1,JiachenZhang,etal.Studyonthepurificationandcharacterizationofapolysaccharideconjugatefromteaflowers.[J]InternationalJournalofBiologicalMacromolecules.47()266–270.[2]JinweiLi,LiupingFan,ShaodongDing.Isolation，purificationandstructureofanewwater-solublepolysaccharidefromZizyphusjujubacv.Jinsixiaozao.[J]CarbohydratePolymers.83()477–482.[3]LiyanZhao,YanhongDong,GuitangChen,etal.Extraction，purification，characterizationandantitumoractivityofpolysaccharidesfromGanodermalucidum.[J]CarbohydratePolymers.80()783–789.[4]GuoRui1,CAOYan－ping2,SHIYu1,CAOYang,etal.Purifyingdermatansulfatefromthewasteinheparinproduction.[J]ScienceandTechnologyofFoodIndustry.1002－0306()03－0224－06.[5]SunXiao-chun,YANJun,HEGang,etal.PurificationandAnalysisofMonosaccharideCompositionofLigusticumchuanxiongpolysaccharide.[J]JournalofSichuanAgriculturalUniversity.1000-2650-()01-0056-05.[6]QiaoYanru1,LUOYonghuang,ZHOUShuai,etal.IsolationandPurificationofGFP75-2-2B,aPolysaccharidefromGrifolafrondosaFruitBodies，anditsEffectonNitricOxideReleasefromMacrophages.[J]JournalofAgriculturalSciences..17(4):48-51.[7]SongGuang-lei,DUQi-zhen.Studyonseparationandpurificationofkelppolysaccharidebyusingcountercurrentchromatographyandultrafiltrationgradeseparationmethod.[J]ScienceandTechnologyofFoodIndustry.1002-0306()02-0265-005.[8]YeHong,ZHOUChun－hong,ZENGXiao－xiong.SeparationofPolysaccharidesfromSargassumpallidumbyMembraneTechnology.[J]HubeiAgriculturalScienc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多糖纯化：

a、分部沉淀法：依照各种多糖在不同浓度低档醇或丙酮中具备不同溶解度性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出沉淀，经重复溶解与沉淀后，直到测得物理常数恒定（最惯用是比旋光度测定或电泳检查）。这种办法适合于分离各种溶解度相差较大多糖。为了多糖稳定，常在pH7进行，唯酸性多糖在pH7时－COOH是以－COO`离子形式存在，需在pH2－4进行分离，为了防止苷键水解，操作宜迅速。此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等，然后将多糖衍生物溶于醇中，最后加入乙醚等极性更小溶剂进行分级沉淀分离。

b、盐析法：在天然产物水提液中，加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度减少沉淀析出，与其他水溶性较大杂质分离。常做盐析无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。

c、季铵盐沉淀法：季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，惯用于酸性多糖分离。普通季胺盐及其氢氧化物并不与中性多糖产生沉淀，但当溶液PH增高或加入硼砂缓冲液使糖酸度增高时，也会与中性多糖形成沉淀。惯用季铵盐有十六烷基三甲胺溴化物（CTAB）及其氢氧化物（cetyltrimethylammoniumhydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinmhydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH浓度普通为1％－10％（W/V）多糖溶液中，酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来，因此控制季铵盐浓度也能分离各种不同酸性多糖。值得注意是酸性多糖混合物溶液PH要不大于9，并且不能有硼砂存在，否则中性多糖将会被沉淀出来

d、柱层析：

纤维素柱层析：纤维素柱层析对多糖分离既有吸附色谱性质，又具备分派色谱性质，所用洗脱剂是水和不同浓度乙醇水溶液，流出柱先后顺序普通是水溶性大先出柱，水溶性差最后出柱，与分级沉淀法正好相反。

纤维素阴离子互换柱层析：最常用互换剂为DEAE－纤维素（硼酸型或碱型），洗脱剂可用不同浓度碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。此办法当前最为惯用。它一方面可纯化多糖，另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。

凝胶柱层析：凝胶柱层析可将多糖按分子大小和形状不同分离开来，惯用凝胶有葡聚糖凝胶（sephadexG）、琼脂糖凝胶（sepharosebio－gelA）、聚丙烯酰胺凝胶（bio－gelP）等，惯用洗脱剂是各种浓度盐溶液及缓冲液，但它们离子强度最佳不低于0.02。出柱顺序是大分子先出柱，小分子后出柱。由于糖分子与凝胶间互相作用，洗脱液体积与蛋白质分离有很大差别。在多糖分离时，普通是用孔隙小凝胶如sephadexG－25、G－50等先脱去多糖中无机盐及小分子化合物，然后再用孔隙大凝胶sephadexG－200等进行分离。凝胶柱层析法不适合于粘多糖分离。柱层析原理:

柱层析法分离原理是依照物质在硅胶上吸附力不同而使各组分分离。普通状况下极性较大物质易被硅胶吸附，极性较弱物质不易被硅胶吸附。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸过程，吸附力较强组分，移动距离小，后出柱；吸附力较弱组分，移动距离大，先出柱。

硅胶柱层析流动相：

极性小用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大用甲醇：氯仿系统；极性大用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸

普通都是运用极性相似相容原理，看流动相与固定相极性，大某些是固定相极性不大于流动相，然后流动相极性与所要洗脱物质极性比较接近，从而将物质洗脱下来。一级构造：单糖构成、糖苷键类型：搞碘酸盐氧化、Smith降解、甲基化

二级构造：侧链类型、位置

三级构造：空间构造：刚果红显色扫描，X-晶体衍射分析

并且每一步都要以红外光谱、C-13核磁共振谱作跟踪一级构造要弄清晰主侧链单糖构成、糖基数量、糖苷键类型，从而拟定重复单位构造。重要通过酸水解后GC分析拟定单糖构成、HPLC（TSK柱）或凝胶色谱法测分子量以拟定糖基数量，某些酸水解、高碘酸盐氧化、Smith降解、甲基化分析、核磁共振，共同拟定主侧链糖苷键类型、位置。

发点自己在多糖构造解析一点心得，和人们共同讨论

食（药）菌多糖构造分析办法普通来说可以分为两大类：一类是老式化学办法，一类是波谱学办法。

2.1化学办法

化学办法是用来对某些简朴单糖、二糖和寡糖进行分析典型办法，同步亦可应用在多糖构造解析上。它是通过完全酸水解、某些酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析和气质联用对多糖进行解析。

2.1.1水解法

水解法通过完全水解将多糖链分解成单糖，这是分析多糖链构成成分重要手段。水解法涉及完全酸水解、某些酸水解、乙酰解和甲醇解等。水解后多糖通过中和、过滤可采用气相色谱、纸层析、薄层层析、高效液相色谱仪[8]和离子色谱法[9]进行分析。

2.1.2高碘酸氧化法

高碘酸可以选取性氧化断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处，生成相应多糖醛、甲酸，反映定量进行，每裂开一种C—C键消耗一分子高碘酸，通过测定高碘酸消耗量及甲酸释放量，可以判断糖苷键位置、直链多糖聚合度和支链多糖分枝数[10]。

2.1.3Smith降解

Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或某些水解。由于糖残基之间以不同位置缩合，用高碘酸氧化后则生成不同产物。依照降解产物可以推断糖苷键位置。在降解产物中若有赤藓糖生成，则提示多糖具备1→4结合糖苷键；若有甘油生成，则提示有1→6、1→2结合糖苷键或有还原末端葡萄糖残基；若能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等,则有1→3糖苷键结合存在[11]。

2.1.4甲基化反映

甲基化反映是用甲基化试剂将各种单糖残基中游离羟基所有甲基化，进而将甲基化多糖水解后得到化合物，其羟基所在位置即为本来单糖残基连接位置。甲基化反映核心在于甲基化与否完全，普通采用红外光谱法检测3500㎝-1处有无吸取峰,以此来判断甲基化多糖中与否具有游离羟基(-OH)。甲基化办法有Purdie法、Hamorth法、Menzies法和Hakomori法等[12]。当前使用较多是Ciucanu和Kerek[13]办法,它是将多糖样品溶解在DMSO中,加入NaOH粉末和碘甲烷，混合在密封瓶中25℃搅拌6min即可,办法简朴,重复性好。

2.2波谱学办法

食（药）用菌多糖由于构造比较复杂，仅用老式化学办法完全解析多糖构造是十分困难，必要运用波谱学知识进行解析。在食（药）用菌多糖中惯用波谱学办法有紫外分光光度计法、红外光谱法和核磁共振法。

2.2.1紫外分光光度计法

用苯酚硫酸法（490nm）进行多糖含量测定;280nm处有无吸取峰来检测与否具有蛋白质和在260nm处有无吸取峰来判断与否具有核酸;在620nm处有无吸取峰来判断有无色素[14];在206nm处有无吸取峰来判断与否具有多糖[15]。

2.2.2红外光谱法

红外光谱分析多糖构造，可以鉴定多糖构型，如：α构型多糖常浮现844±8cm-1峰,而β构型多糖浮现891±7cm-1峰。糖键上重要取代基特性谱为分子间、内氢键使糖羟基在3600～3200cm-1处浮现一宽峰，磷酸基在1300～1250cm-1处有P=O伸缩振动峰，磺酸基在1240cm-1处有S=O伸缩振动峰，酯胺在1650、1550cm-1附近浮现振动吸取。吡喃糖苷在1100～1010cm-1处应有3个吸取峰，而呋喃糖苷在相应区域只浮现2个峰[16]。

2.2.3核磁共振法

运用核磁共振技术可以在有或没有构造背景知识状况下获得碳水化合物最完全构造信息，它突破了用化学办法测定多糖构造局限性，为复杂多糖构造解析提供了有利工具。通过综合考虑一维、二维图谱，互相验证，得到更为精确多糖构造信息。核磁共振波谱多糖构造分析办法简介如下。

2.2.3.1糖残基数拟定

4.3～5.9异头氢区域，导致假象。因此对于在1HNMR谱和13CNMR谱中信号峰数目不同样时，还要通过1H-1HCOSY谱和1H-13CCOSY谱进行验证，进而拟定多糖中糖残基数[17]。90～112之间。依照浮现信号峰来拟定多糖糖残基数。但是在1HNMR谱中，异头氢区域信号不一定都是异头氢信号，例如在O-乙酰基取代碳上氢，虽然不是异头氢，但是其氢化学位移会由于O-乙酰基取代而向低场移动到4.3～5.9之间；在13CNMR谱中，异头碳化学位移普通在多糖是由单糖以一定连接方式构成重复构造单元，由一种或各种单糖构成，因此拟定多糖糖残基数是很重要。普通来说，糖残基数是依照多糖异头氢和异头碳来拟定。在1HNMR谱中，异头氢化学位移在

2.2.3.2单糖构型拟定

82～84之间有信号，也是区别呋喃糖构型和吡喃糖构型重要根据[19]，[20]。吡喃糖构型大体又涉及葡萄糖构型（葡萄糖和异鼠李糖）、甘露糖构型（甘露糖和鼠李糖）和半乳糖构型（半乳糖、岩藻糖）。葡萄糖构型可以通过J2,3,J3,4,J4,5在8～10Hz之间来判断[21]，还可以通过H2高场化学位移特性来判断。或者是在TOCSY谱中，具备一种H1～H6完全自旋系统，也可以视为葡萄糖构型[22]。甘露糖构型可以通过J1，2(0～2.0Hz)非常小和J4,5(8～10Hz)大偶合常数来拟定甘露糖构型[23]。由于J3,4和J4,5较小（J3,4和J4,5103～112,并且呋喃糖糖醛糖C4和呋喃糖糖酮糖C5在5.4左右，J1,2不大于2Hz,此是呋喃糖构型区别于吡喃糖构型重要特性[18]。在13CNMR谱中，异头碳化学位移在构成多糖单糖普通可以分为呋喃糖构型和吡喃糖构型。在1HNMR谱中，呋喃糖构型异头氢化学位移在<3Hz）,阻碍了从H1→H6有关传递，由此可以推断半乳糖构型存在[24]，同步H4相对于其她单糖残基而位于低场区域[26]也可作为判断半乳糖构型根据。在TOCSY谱中只能推出H1→H4[26]和在NOESY谱中H4与H3和H5有强NOE效应也是半乳糖构型重要特性[27]。

2.2.3.3单糖组分化学位移拟定

普通来说，可以通过1HNMR谱、1H-1HCOSY谱和TOCSY（HOHAHA）谱推出单糖上各碳上氢化学位移，然后依照13CNMR谱和1H-13CCOSY谱（HMQC谱和HSQC谱）推出碳化学位移。但是对于不同构型还略微不同，例如半乳糖构型，因J3,4和J4,5较小，阻碍了交叉峰浮现，可以从1H-1HCOSY谱中交叉峰推出H1，H2和H3。由于H3和H4在1H-1HCOSY谱中J3,4较小，因此没有交叉峰浮现，因而H4可以通过TOCSY（或HOHAHA）谱得出，依照H1有关交叉峰进行判断；H5可由NOESY谱得出，由于H3和H4与H5信号有关。H6可以通过1H-1HCOSY谱和TOCSY（或HOHAHA）谱得出，由于H5和H6在此谱上有交叉峰。H5和H6与H1和H4与否在同一糖环中，还可以通过HMBC谱，H1和C5有关、H5和C4有关、H6和C5有关来证明H5、H6是同一糖残基上氢。碳化学位移可由HMQC谱来推断，对于未被推出，可用HMQC-TOCSY谱进行辅助，例如：H1与C1、C2、C3和C4有关，C5与H5、H6a和H6b有关，还可以通过HMBC谱进行验证，如：H1与C3、C5，H2与C1，H4与C5和C6有关等[28，29]。而甘露糖构型由于J1,2较小，因此常采用DQF-COSY谱和TOCSY谱结合来拟定H化学位移[30]。

2.2.3.4异头构型判断

4.4～4.8之间，JH1,H2在6～8Hz之间，双峰[17]。但是甘露糖构型不能用此办法来判断。由于J1，2非常小，不能用J1,2间偶合常数来拟定甘露糖α或β构型,需通过该单糖残基上H5[24]和C5[33]化学位移与已知单糖