农作物种子检验规程 品种质量 转基因成分检测 征求意见稿

本文件规定了农作物种子转基因成分有无、性状真实性、性状纯度的测定内容、测定方案设计、测定技术选择、结果表述和报告等相关要求。本文件适用于农作物种子。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.1农作物种子检验规程总则GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1转基因特性3.1.1转基因transgene来源不同物种的外源遗传构造，或来源于同一物种的同源遗传构造导入生物体，该生物所表现的新性状并能遗传给下一代的过程。3.1.2转基因生物geneticallymodifiedorganism（GMO）利用转基因技术引入外源基因改变基因组构成，获得具有新遗传性状并能遗传给其后代的新生物体。3.1.3转基因含量GMOcontent观测单位（3.2.8）中转基因成分的质（数）量/拷贝数与总质（数）量/总拷贝数的百分3.1.4转化事件GMOevent在作物基因组的某个特定位点插入异源或同源基因，由此形成异源或同源转基因植株，并以此作为培育新品种材料的单一转化行为。3.1.5叠加事件stackedevent通过传统育种回交和/或连续转化步骤而累积的两个或多个没有遗传关联的转化事件。叠加事件形成的性状亦称为复合性状。3.2转基因测定3.2.1意外混入adventitiouspresence（AP）在种子生产、收获、加工、贮存或销售环节中，种子批中意外或偶然混入含有转基因成分种子。3.2.2性状纯度traitpurity（TP）种子批中特定转基因成分或特定转基因性状所占的比例。3.2.3定性测定qualitativeassay通过聚合酶链式反应（PCR）、免疫层析试纸条、生物测定等方法测定特定转基因性状（如耐除草剂）或目标分析物（3.2.8评估观测单位（3.2.5）是否存在转基因成分或特定转基因性状。3.2.4定量测定quantitativeassay的转基因成分或特定转基因性状的比例。注：从检验实践来看，有时定量测定往往仅能获得观测单位的定性信息。3.2.5观测单位unitofobservation用来开展某一测定活动的全部或部分试样组分，其中，可以是种子或幼苗个体，也可以是一份种子或幼苗的组样或混样。3.2.6组样seedgroup无论是整个试样，还是用来进行后续研磨和测定准备的次级样品，其个体（种子或幼苗）组成数量已知的观测单位。无论是定量测定还是定性测定，通过对多个组样进行测定，应能对种子批状况作出统计判定。注：在Seedcalc软件中，组样称为库（pool）。3.2.7混样seedbulk无论是整个试样，还是用来进行后续研磨和测定准备的次级样品，只知个体（种子或幼苗）组成的质量（重量）而不知数量的观测单位。进行定量测定时，通过对混样进行测定，不能对种子批次进行统计判定，仅能对样品进行统计推断。3.2.8目标分析物targetanalyte被提取用于测定的靶标物质或特定性状，如特定的外源蛋白、特异核酸序列、表现型效4测定内容果等。3.3测定过程控制3.3.1检出限limitofdetection（LOD）在给定的置信水平下，能够被稳定检出的目标分析物(3.2.8)最低含量。3.3.2定量限limitofquantification（LOQ）在规定的精确度和准确度水平下，能够被定量检出的目标分析物(3.2.8)最低含量。3.3.3假阴性率falsenegativerate（FNR）所使用的方法将已知阳性种子组样试样归为阴性的概率。3.3.4假阳性率falsepositiverate（FPR）所使用的方法将已知阴性组样试样归为阳性的概率。3.3.5参考物质referencematerial(RM)用于测定比对、参照或校准等用途的足够均匀且稳定的材料。3.3.6有证参考物质certifiedreferencematerial（CRM）经认可、能够溯源并附有证书的参考物质（见3.3.5），也称标准物质。3.4测定结果应用3.4.1可接受质量限度acceptablequalitylimit（AQL）种子生产者可接受的质量不纯的限度。3.4.2最低质量限lowerqualitylimit（LQL）种子使用者所容忍的最高不纯的限度。3.4.3偏离种子deviantseed与预期靶标或已知的转基因性状不符的种子。3.4.4淘汰/接受指标reject/acceptcriterion在可接受种子的试样中，测定到的最大偏离种子组数。4.1测定目标转基因种子测定是描述转基因成分有无、转化体真实性、转基因特定性状纯度等多个指标的一个综合概念。应依据测定需求，确定测定目标。转基因种子测定目标，主要包含以下两个层次：a)第一层次是目标分析物属于意外混入（AP），还是性状纯度（TP）。这两种测定目标的预期结果有所不同。在AP测定中，预期结果大多数情况下是“未检出”或者测定存在低于阈值的转基因成分含量；而在TP测定中，预期结果是测出存在高百分比的特定性状纯度。b)第二层次是目标分析物成分有无（是否存在），还是含量高低（所含比例）。对于“成分有无”，评估是否存在转基因成分，回答的是诸如“样品中是否有转基因成分”等问题，由于测定目标分析物的类型不同，有的是属于如外源蛋白、启动子、终止子等筛查性质，有的是属于转化体识别的鉴定性质；对于“含量高低”，测定所含的转基因成分含量或性状纯度，回答的是诸如“种子批有多少属于转基因种子”等问题，例如：耐除草剂的纯度为98.0%，抗虫的纯度为95.0%。4.2测定路径测定目标的不同，决定了其所选择测定路径是不同的。测定路径主要由分析类型、观测单位等因素所决定。测定路径，主要选择以下两方面的相关内容：a)分析类型是采用定性测定，还是定量测定。对于“成分有无”，采用定性测定方法评估是否存在转基因成分；对于“含量高低”，采用多重定性测定或定量测定测定所含的转基因成分含量或性状纯度。b)观测单位是采用个体，还是组样或混样。对于“成分有无”，属于定性测定，采用定性测定采用组样或个体（单粒种子或单株幼苗）为观测单位，定量测定采用组样或混样为观测单位，目标分析物为外源蛋白、特异核酸序列或特定表型。根据不同的测定方法，可选择一个或多个观测单位（即多个个体、一组或多组的组样或混样）作为试样进行测定。对于定性测定，组样或混样的大小应与测定方法在检出限方面的性能一致，以便能够有效测定；对于定量测定，组样或混样的大小应确保组样或混样中的含量水平高于定量限。转基因种子分析类型和观测单位的关系见表1。表1转基因测定路径分析类型4.3测定流程转基因种子测定流程见图1。图1转基因种子测定流程图模糊（估测改成测定）5测定方案设计5.1测定方案内容依据测定目标和测定路径，选定测定方案，确定组样种子数量、组样数目、淘汰/接受指标等。每组由确定数量的种子组成，并对是否存在转基因成分进行定性测定。对转基因阳性组数，与种子组样总数比较进行统计评估，以确定转基因含量。最低质量限（LQL）和可接受质量限（AQL）分别反映种子使用者和种子生产者的风险。假阴性率（FNR）、假阳性率（FPR）、测量变异系数（CV）、标准偏差（SD）等参数是评价测定方法准确性的重要指标。试样所需的最低种子数目，通常是指在给定LQL的状况下，95%以上的概率能找到至少一粒转基因种子。在不考虑种子生产者风险下，其试样的最低大小见表2，比如，LQL为1.00%，所需测定的最低种子数量为298粒。表2转基因不同限量水平下的最低试验样品数量5.2测定步骤5.2.1单一步骤从试样中进行组样取样、评估，然后依据结果决定是否接受种子试验样品。在单一步骤测定方案中，应从试验样品中随机选择规定数量的种子或种子组样进行测定。依据测定到的偏离种子与方案中规定的最大偏离种子数量比较，得出种子批次接受或淘汰的结论。5.2.2双重步骤从测定样品中取出第一步骤种子组样进行测定，依据该测定结果，可以做出接受种子批、淘汰种子批、从测定样品中抽取第二步骤种子组样进行重新测定等三种不同的决定。决定采用第二步骤测定后，将第一步骤和第二步骤的试验结果结合起来，得出种子批次接受或淘汰的结论。5.3测定方案示例种子中转基因成分含量是否超过0.1%阈值、是否超过3%阈值（存在转基因叠加事件）、耐除草剂性状纯度是否超过98%阈值的测定方案实例，参见附录A。6测定技术选择6.1总则转基因种子测定可分为基于DNA、外源蛋白质、生物测定等三类方法。考虑测定目标以及测定路径，选择其中一种或几种类别的测定方法。由于转基因技术的快速发展，新的外源基因和转化事件不断出现，与之相对应的测定方法标准也在不断增加。本文件不规定具体的方法，有关具体测定方法建议可选择已通过认可的测定方法标准，如国家标准（GB/T）、农业农村部（农业部）公告（包括NY/T）等现行有效的测定方法标准。其中基于核酸测定的常用元件筛查基因、转化事件测定方法参见附录B，基于蛋白质测定的方法参加附录C。转基因种子的扦样，按照《GB/TXXXXX农作物种子检验规程扦样》的相关要求。6.2DNA测定方法6.2.1总则DNA方法的主要步骤包括种子样品检查、磨碎样品获取均匀粉末，称取适量的粉末提取DNA、利用特异引物（探针）进行DNA扩增、通过终点PCR或实时荧光PCR等方法测定扩增产物，其通用程序参见附录B。使用PCR方法进行测定，不同测定方式在特异性方面有所不同：——采用转基因通用元件筛查，所选引物扩增的靶标序列通常会在许多不同的转化事件中普遍存在。这种目标分析物测定结果只能表明是否含有转基因成分。——采用特定载体结构测定，所选引物扩增的靶标序列通常包括调控元件和功能基因，这种目标分析物测定结果表明转化事件是否含有该载体结构。——采用转化事件测定，所设计引物专门用来测定特定外源转基因事件与植物基因组的唯一整合位点，其阳性结果表明含有特定的转化事件。在测定过程中，应有措施确保避免来自粉尘、提取DNA或者扩增DNA片段对样品所产生的污染，并设置必要的对照样品，如阳性对照、阴性对照、空白对照等，可使用标准物质作为阳性对照。6.2.2终点PCR终点PCR按照标准PCR扩增的步骤执行，在过程结束后对扩增的产物进行检测，可观察电泳后的凝胶，也可测量荧光的信号。采用凝胶电泳测定，若出现与目标片段大小相同的条带，结果判定为阳性；若没有出现相应大小的条带，则结果判定为阴性。采用荧光信号测定，将荧光信号与合适的阳性对照、阴性对照测定值比较，判定测定结果。终点PCR方法主要用于定性测定。6.2.3实时荧光PCR采用实时荧光PCR，可以实时监测DNA扩增产物激活标记在引物或探针上的荧光信号，从而能测定每个循环中被扩增的DNA分子数量。由于激活的荧光基团也可以插入扩增的非特异性PCR产物中，应特别注意假阳性结果。实时荧光PCR用于定性测定，若荧光信号在给定的PCR循环数之前高于定义的阈值，则该测定结果为阳性。此外，当使用嵌入染料时，应通过检查熔解温度（Tm值）或通过其他合适的方式来鉴定扩增产物。实时荧光PCR用于定量测定，应采用标准物质制作标准曲线设计靶标基因的定量实验，其实验设置和结果报告应遵循统计学上能够接受的、合理的统计方法。6.3蛋白质测定方法6.3.1总则蛋白质测定是应用抗原抗体特异结合的免疫分析的方法。测定种子或幼苗中的外源蛋白质，需要材料磨碎并用纯净水或适宜的缓冲液提取。对于仅在绿色组织中表达的蛋白质（如Bt176转化事件的Cry1Ab），或者需要绿色组织表达高于某一阈值水平的蛋白质，采用免疫分析能够较好用于测定个体是否含有转基因成分。蛋白测定也需采取预防措施。蛋白测定可能因蛋白质特性、提取过程和缓冲液、以及种子种类不同而有所不同，尤其是油菜种子的高含油量、棉花种子的棉酚和其他化合物，以及品种不同、种子成熟度或种子水分的差异，可能会给测定带来误差；应通过加标试验和重复试验，确认目标分析物的提取和测定方法。蛋白质通常会快速降解，提取宜在4℃左右进行，提取后应快速使用混合物或在低温下贮存。使用商用的试纸条或ELISA试剂盒，应按照供应商提供的规程操作，其分析条件事先应在检验室条件下进行内部确认。通常不建议使用基于蛋白质的测定方法用于AP混样的定量测定，因为样品类型（例如种质、种子成熟度）、提取和测定方法的变化，可能引起提取物中的目标蛋白质含量变化，并导致难以准确测定转基因含量。蛋白质测定与特定的转化事件并不总是相关的，因为不同转化事件（例如：NK603/MON88017；MON810/Bt11）、相同或不同的作物种类（如玉米的T25、大豆的LL55）可包含相同的外源蛋白质。6.3.2免疫层析试纸条测定免疫层析试纸条上固定有外源蛋白质的特异抗体，当试纸条浸入蛋白质提取液中，出现检测线和控制线两条带，表明样品中含有目标外源蛋白质，测定结果判为阳性；若只出现一条控制线条带，表明样品中未检出目标蛋白质，测定结果判为阴性；若控制线未出现条带，测定结果判为无效。应在规定时间内读取结果，避免因长时间反应出现非特异性显色而产生的假阳性结果。6.3.3酶联免疫吸附测定（ELISA）ELISA方法，采取提取的蛋白质与酶标板表面的抗原或抗体反应，经过洗涤使形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，加入酶反应的底物后被催化变为有色产物，产物的量与样品中外源蛋白质的量直接相关，从而依据颜色反应的深浅进行外源蛋白质定性或定量测定。6.4生物测定方法6.4.1总则生物测定是直观评定对种子或幼苗进行处理的特定表型。最常见的是确定是否具有耐除草剂性状的转基因种子，以及是否具有抗虫性状的转基因种子。由于多个转化事件可能存在相同的耐除草剂表型，生物测定不能确定特定的转化事件。生物测定应设置阳性对照和阴性对照进行质量控制。6.4.2耐除草剂种子测定耐除草剂种子测定是一种常用的生物测定。通常每一试样测定400粒种子，将种子播种在经一定浓度特定除草剂处理的发芽床上发芽，观察幼苗伤害情况。耐除草剂的种子或幼苗能够正常生长而被记录为阳性，不耐除草剂的种子或幼苗不能正常地生长被记录为阴性。测定应确定每种作物种类及其生长阶段的施加除草剂的最适浓度。测定结果应记录施喷除草剂前后的种苗数量，计算耐除草剂表型的比例。7结果计算与表述7.1考虑测定内容测定样品或种子批中是否存在转基因成分或者特定性状，还是测定样品或种子批中转基因成分或者特定性状的含量及相应测量不确定度，其结果计算和表述方式是有所不同的。应考虑送验者申请的测定内容，确定结果计算和表述方式。对于同一种子中存在两个或两个以上的叠加转化事件的评估，通常采取检测个体（单粒种子）的路径。若以组样或混样进行测定，则不能证实叠加转化事件的存在，但可以通过一些统计工具对两个或三个叠加转化事件的种子比例进行估测。7.2采用计量单位对于定量测定，应依据测定的不同需求和不同状况，考虑送验者申请的要求，明确相应的结果表示的计量单位。对于定量测定，采用目标分析物含量的方式进行表述：对于使用个体、组样测定的，用样品中含有转基因种子数目占测定种子总数的百分率表示。对于试样中转基因成分有标准物质可与其标准曲线进行比较的，可用样品中转基因含量的质量百分率表示。对于试样中转基因成分有标准物质可与其标准曲线进行比较或使用数字PCR的，也可根据需要用转基因含量的拷贝数表示。7.3使用统计软件测定方案的设计和相关结果计算，可使用Seedcalc或具备类似功能的软件。注：Seedcalc可从ISTA网站（)下载。8结果报告8.1测定结果测定结果应执行《GB/T3543农作物种子检验规程总则》的检验报告要求，并按照下列的不同测定路径进行填报：a)使用定性测定方法评估转基因成分有无依据目标分析物测定结果，建议采用下列格式表述：——未测定到目标分析物，表述为“未检出目标分析物”；——测定到目标分析物，表述为“检出目标分析物”。通过定性测定获得的阴性结果，即使是单一组样，允许表明“该种子批在...%概率下符合...%（最大或最小阈值）的要求”。b)使用多重定性测定方法测定转基因含量采用个体或组样测定，应填报所测定的种子总数、组样数量、每组种子数量等信息。依据测定结果，建议采用下列格式表述：——未测定到目标分析物，表述为“未检出目标分析物”；——检出目标分析物，表述为“种子批检出目标分析物的种子为…%，在95%概率下置信区间为[…%，…%]”，或“对于指定的目标分析物，种子批在…%置信度符合…%(最大值或最小值)标准的要求”。若结果未显示种子批在期望置信度下符合给定规范的证据，则填报具有95%置信区间的估计种子百分比。c)使用定量测定方法测定转基因成分含量填报结果应与测定目标分析物的质量百分比或DNA拷贝数有关。依据测定结果，建议采用下列格式表述：——未测定到目标物（没有信号或低于检出限表述为“在高于检出限的水平上，未检出目标分析物”；对于高于检出限且低于定量限的水平上测定到目标物，表述为“在低于使用方法定量限的水平上，检出目标物”；——在高于定量限的水平上测定到目标物，表述为“种子样品（如是混样）/种子批次（如是组样）中的目标分析物百分比为……%（以数量、质量或拷贝数计在95%概率下的置信区间为[…%，…%]”，或“对于指定的目标分析物，样品（如是混样）/种子批次（如是组样）符合…%数量、质量或拷贝数的要求（最大或最小），置信度为…%”。若结果未显示种子批次在期望置信度下符合给定规范的证据，则报告具有95%置信区间的估计质量百分比或拷贝数。8.2附加信息附加信息应至少包含以下内容：a)测定目标、测定目标分析物和测定技术方法；b)试样描述（例如：净种子、有无杂质、有无其他植物种子、有无包衣、有无洗涤种子等信息）；试样种子数量（或重量），对于转基因含量分析，均应注明组样或混样的数量、每一组样或混样磨碎样的重复数，以及每个磨碎样的重复数量；c)所用标准物质的来源和描述（标准物质及其提供者），确认的方法检出限（适用定性测定），确认的方法定量限（适用定量测定）。（资料性）转基因种子测定方案常见实例A.1玉米、油菜种子转基因成分含量是否超过0.1%阈值测定对于转基因种子低含量测定，需要有较大的样品数量才有可能检出阳性结果，阳性结果与转基因种子含量范围测定见表A.1（基于Seedcalc计算所得）。表A.1组样转基因阳性与转基因成分含量范围测定例303132606162636465以玉米、油菜种子采用实时荧光PCR方法，确定转基因种子含量是否超过0.1%阈值，考虑表2的组样阳性结果与含量范围测定，设计了双重步骤的测定方案，见表A.2，结果判定的流程见图A.1。第一步骤：从试样中分取3个各1000粒的组样进行测定，若组样没有检出阳性，则判为“未检出转基因成分，在95%的概率下转基因含量小于0.1%”；若组样只有1组检出阳性，则需要进行第二步骤进行判定；若组样多于1组检出阳性，则判为“检出转基因成分，在95%的概率下转基因含量大于0.1%”。第二步骤：对于组样只有1组检出阳性的需要再分取3个各1000粒的组样进行测定，若没有再检出阳性组样，则判定“检出转基因成分，在95%的概率下转基若再检出阳性组样，则判为“检出转基因成分，在95%的概率下转基因含量大于0.1%”。作为建议，对于第一步骤3个组样均出现阳性的，可选择分取3个各100粒的组样对转基因种子进行附加测定，若出现低于2组阳性（或者没有判为“检出转基因成分，在95%的概率下转基因成分含量大于0.1%”；若3组出现阳性，应进行实时PCR定时分析，定量实时PCR测定或Cq值比较有助于区分阳性信号，是来自样品的转基因种子，还是由其他同质存在物质的痕迹（例如灰尘、包衣）所引起的。应进行实时荧光PCR定性或定量测定，或Ct比较进行阳性信号判别，区分阳性结果是由试样中转基因种子，还是环境中其他物质（例如灰尘、包衣）所引起的。表A.2转基因低含量的测定方案子图A.1转基因种子含量是否超过0.1%阈值的结果判定流程A.2玉米种子转基因成分是否超过3%测定（注意调整数据）若种子批存在转基因叠加事件，通过实时荧光PCR测定转基因含量可能会高估种子批的实际比例。引入组样测定策略，依据给定的淘汰/接受指标评价转基因含量，可以不考虑种子批中是否存在叠加事件。给出的测定策略，旨在确定玉米种子批转基因含量是否超过3%（m/m）。其测定方案如表A.3所示，结果判定的流程见图A.2。表A.3转基因叠加事件的测定方案图A.2转基因种子含量是否超过51%阈值的结果判定流程A.3耐除草剂性状纯度是否超过98%阈值的测定耐除草剂种子的TP测定，用于检查种子批中具有耐除草剂等特定性状的种子百分比是否超过规定阈值。采用表型鉴定的方法，将有代表性的种子样品，播种在土壤中，在特定的叶期采用适当浓度的除草剂喷洒幼苗，也可将种子置于含有除草剂的发芽纸或其他介质上，有发芽率种子耐除草剂的幼苗正常生长，计算耐除草剂种子的比例。异常或未发芽的种子不计入计数。耐除草剂性状纯度的测定方案见表A.4。该分析方法通常在400粒种子样品上进行。100粒种子的四个重复通常用于测定种子批的发芽试验和耐除草剂性。如果测定种子的接受阈值在97%至99%的范围内，则使用400种子能有合理的机会获得有意义的结果。如果预期种子批非常纯，则可以测定较少数量的种子（例如，200粒种子）。表A.4耐除草剂性状纯度的测定方案可以使用多种分析方法进行测定。这取决于种子或幼苗对除草剂的耐受性，用PCR法测定靶标基因的存在，或用蛋白质分析法测定外源蛋白质的表达。假设耐性幼苗数量的分布是二项分布，其幼苗的阈值计算为等于LQL的真实纯度百分比。若有一种子批，取400粒种子，经发芽试验，有390粒种子发芽，喷洒适宜浓度除草剂后，发芽的390颗幼苗有5颗死亡，那么其性状纯度为（390-5）/390=98.7%，在95%概率下其下限为97.32%，与阈值为98%的标准比较，高于其LQL的96.42%，则可判定该种子批可接受。采用两重步骤测定方案，可降低种子生产者风险。进行第二步骤测定与第一步骤测定结果相关，不能使用单一步骤测定所用的统计数据，两重步骤测定的淘汰/接受指标可使用Seedcalc的“定性方案设计”进行确定。为了简化结果和判定，可以构建一个进行单一步骤测定的结果判定合格/不合格表格，显示发芽率范围与允许的偏离种子数量。耐除草剂性状纯度单一步骤的测定方案见表A.5。使用400种子、性状纯度阈值为98%，LQL为96.42%，种子使用者有风险为5%的结果判定合格/不合格。表A.6为采用两重步骤测定，两步骤均使用同样的400粒，性状纯度阈值为98%或更高，LQL为96.4%，种子使用者有风险为5%或更低的结果判定合格/不合格。考虑到发芽率低于75%的不具有商业销售价值，表中均未显示其结果。表A.5进行单一步骤测定阈值为98%的接受指标表A.6进行两重步骤测定阈值为98%的接受指标目苗（偏离种子）总数>16>15>14>13>13>12（资料性）基于DNA的测定方法B.1终点定性PCR法B.1.1仪器设备和试剂B.1.1.1仪器设备a)组织研磨仪、离心机、水浴锅或金属浴；b)紫外分光光度计或核酸浓度测定仪、PCR扩增仪、电泳仪、琼脂糖凝胶电泳槽及制胶附件、凝胶成像系统或紫外透射仪、微量移液器;c)电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器、微波炉、冰箱、纯水仪或重蒸馏水发生器等。B.1.1.2试剂a)植物DNA提取试剂盒或植物DNA提取试剂；b)琼脂糖；c)溴化乙锭（EB）溶液：10mg/mL；注：EB有轻微致癌作用，配制和使用时需戴一次性手套操作并妥善处理废液。d)50×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris用500mL水加热搅拌溶解，加入500mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（pH8.0）100mL，用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容至1000mL。也可采用经验证的、效果相当的商品化TAE缓冲液。使用时用水稀释成1×TAE；e)加样缓冲液：称取0.25g溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12h；称取0.25g二甲基苯腈蓝，用10mL水溶解；称取50g蔗糖，用30mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100mL。也可采用经验证的、效果相当的商品化加样缓冲液。在4℃下保存备用；f)DNA分子量标准；g)适用于普通PCR反应的预混液，含有MgCl2,dNPTs,DNA聚合酶（Taq酶)；h)普通PCR引物信息可参考表B.1，用TE缓冲液（pH8.0）或双蒸水分别将引物稀释i)石蜡油；j)除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。子FMV35S-R1:AGGACAGCTCTTTTNOSNOSNOS薯公告第423号米BAR-R:GCTGCCAGAAACCCAC因因菜公告第423号米NptNptC花公告第323号花花HSP70/CryIA(b)-F:AGTTTCCTTTTT米T米因mCP4ES-R:GAACAAGCARGGCMGC因NY/T豆因豆因豆CP4-EPSPS-F:GACTTGCGTGCP4-EPSPS-R:AACACCGTTG菜农业部953号稻花NY/T豆ubiquitin麦麦农业部869号菜菜农业部869号Bt176-F1:TTCAAGCACGGGABt176-R1:GAGCGAGAACACGTC1507-F:CTTGTGGTGTT农业部869号农业部869号C农业部869号农业部869号农业部953号农业部953号公告第323号公告第323号公告第423号公告第323号公告第423号公告第323号公告第323号公告第423号公告第323号公告第323号公告第423号A2704-F:TGAGGGGGTCAAAGACMon89788-F:CTGCTCCACTCTT公告第323号356043-R:GCCCTTTGGTCAA公告第323号农业部869号农业部869号农业部869号农业部869号农业部953号农业部953号T棉花MON1445公告第323号公告第423号G公告第423号公告第323号公告第323号B.1.2测定程序B.1.2.1DNA提取和纯化按照GB/T3543.XX执行。B.1.2.2PCR扩增B.配制PCR反应体系。在PCR反应管中按表B.2依次加入反应试剂，轻轻混匀，再加约50μL石蜡油（有热盖设备的PCR仪可不加）。每个试样PCR反应设置3次重复。在确保扩增结果的前提下，允许依据检验室条件对PCR反应体系作适当调整，也可采用经验证的、效果相当的定性PCR试剂盒配置反应体系。B.将加好的PCR反应管放在离心机上，500g～3000g离心10s，然后取出PCR反应管，放入PCR仪中。B.进行PCR反应。反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35次循环；72℃延伸7min。在确保扩增结果的前提下，允许依据检验室条件对反应程序作适当调整。反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳测定或在4℃下保存待用。表B.2PCR反应体系B.1.2.3对照PCR扩增在试样PCR反应的同时，应设置PCR阴性对照、PCR阳性对照和PCR空白对照。根据样品特性或检测目的，以所对应作物的非转基因植物基因组DNA作为PCR阴性对照；以含有靶标元件的对应转基因植物基因组DNA或质粒标准分子DNA作为PCR阳性对照；分别以双蒸水和DNA制备空白对照作为PCR空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及试样PCR扩增反应程序与B.1.2.2相同。B.1.2.4电泳及凝胶成像的琼脂糖溶液。按照每100mL琼脂糖溶液中加入5µLEB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板。室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。吸取7µL的PCR产物与适量的加样缓冲液混合后加入点样孔中，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V／cm～5V／cm条件下电泳。B.凝胶成像分析。电泳结束后取出琼脂糖凝胶，轻轻置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照B.和B.的规定执行。B.PCR产物回收。按PCR产物回收试剂盒说明书，回收PCR扩增的DNA片段。B.PCR产物测序验证。将回收的PCR产物克隆测序，与对应目标元件的序列（参见对应标准来源）进行比对，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。B.1.3结果分析B.1.3.1对照检测结果分析PCR反应中，阳性对照的靶标元件得到扩增且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照和空白对照没有扩增出目的片段，表明PCR反应体系正常工作，可按B.1.3.2进行判断。否则，重新检测。B.1.3.2检测结果分析B.在试样PCR反应中，靶标元件没有得到扩增，或扩增出的DNA片段与预期大小不一致，表明样品中未检出该靶标元件；B.在试样PCR反应中，靶标元件片段得到了扩增，且扩增出的DNA片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检出该靶标元件。B.2实时荧光PCR法B.2.1仪器设备和试剂B.2.1.1主要仪器设备a)组织研磨仪、离心机、水浴锅或金属浴;b)紫外分光光度计或核酸浓度测定仪、实时荧光PCR仪、微量移液器;c)电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器、微波炉、冰箱等。B.2.1.2试剂a)植物DNA提取试剂盒或植物DNA提取试剂；b)适用于实时荧光PCR反应的预混液。含有MgCl2，dNPTs，DNA聚合酶（Taq酶);c)实时荧光PCR引物/探针信息可参考表B.3，用TE缓冲液（pH8.0）或双蒸水将引物、探针分别稀释到10µmol/L；d)除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水，或符合GB/T6682规定的一级水。B.2.2测定程序B.2.2.1DNA提取和纯化按照GB/T3543.XX执行。B.2.2.2PCR扩增B.配制PCR反应体系。在PCR反应管中按表B.4依次加入反应试剂，轻轻混匀。每个试样PCR反应设置3次重复。在确保扩增结果的前提下，允许依据检验室条件对PCR反应体系作适当调整，也可采用经验证的、效果相当的定性PCR试剂盒配置反应体系。B.将加好的PCR反应管放在离心机上，500g～3000g离心10s，然后取出PCR反应管，放入实时荧光PCR仪中。B.进行实时荧光PCR反应。反应程序为：第一阶段95℃10min；第二阶段95℃,15s、60℃,60s，共进行40次循环；在第二阶段的60℃时段收集荧光信号。在确保扩增结果的条件，可依据检验室条件对反应程序作适当调整。B.2.2.3对照PCR扩增在试样PCR反应的同时，应设置PCR阴性对照、PCR阳性对照和PCR空白对照。根据样品特性或检测目的，以所对应作物的非转基因植物基因组DNA作为PCR阴性对照；以含有靶标元件的对应转基因植物基因组DNA或质粒标准分子DNA作为PCR阳性对照；分别以双蒸水和DNA制备空白对照作为PCR空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及试样PCR扩增反应程序与B.2.2.2相同。表B.3实时荧光PCR引物/探针35S-QP:TGGACCCCCACCCAC35S-QP:CCACTGACGTAAGGGATGApCaMV35S-QF:GCCTCTGCCGACApCaMV35S-QR:AAGACGTGGTTGGAACGTpCaMV35S-QP:FAM-CAAAGATGGACCCCCACC米、油菜、棉花、水稻、番FMV35S-QF:AAGACATCCACCGAAGFMV35S-QR:AGGACAGCTCTTTTCFMV35S-QP:TGGTCCCCACAAGCCAGCpFMV35S-QF:CGAAGACTTAAAGTTAGTGGGCpFMV35S-QR:TTTTGTCTGGTCCCCACpFMV35S-QP:FAM-TGAAAGTAATCTTGTCAACAT薯、番等NOSPNOS-QF:GACAGAACCGCAAPNOS-QR:TTCTGACGTATGTGCTTAGPNOS-QP:AGCCACTCAGCCGCGpNOSpNOS-QF:GTGACCTTAGGCGACTTTTGpNOS-QR:CGCGGGTTTCTGGAGTTpNOS-QP:FAM-CGCAATAATGGTTTCTGACGTATGTNOSNOS-QF:ATCGTTCAAACATTTGGNOS-QR:ATTGCGGGACTCTAATCATANOS-QP:CATCGCAAGACCGGCAACAGGNOSNOS-QF:GCATGACGTTATTTATGAGATGNOS-QR:TCCTAGTTTGCGCGCTATATTTNOS-QP:AGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGtNOS-QF:ATCGTTCAAACATTtNOS-QR:ATTGCGGGACTCTAATtNOS-QP:FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-米、水稻、油菜、棉花、小麦、番T35S-QF:GTTTCGCTCATT35S-QR:GGGGATCTGGATTTTT35S-QP:GAAACCCTTAGTATGTATTTT35S-QF:TCACCAGTCTCTCTCTACAAT35S-QR:CAACACATGAGCGAAACT35S-QP:TGTGTGAGTAGTTCCCAGATtCaMV35S-QF:GGGGTTTCTTATATGCTCAACA35S-QR:TCACCAGTCTCTCTCTAC35S-QP:FAM-AAACCCTATAAGAACCCT菜pat-QF:GGAGAGGAGACCAGTTGAGApat-QR:GTGTTTGTGGCTCTGTCCTAApat-QP:ATCACAAACCGCGGCCATATCAGCE9-QF:TCTTGTACCATTTGTTGE9-QR:GGACCATATCATTCATTAACTCE9-QP:CGGTTTTCGCTATCGAACTGTGAAAGtE9-QF:TGAGAATGAACAAAAGGACCtE9-QR:TTTTTATTCGGTTTTCGCtE9-QP:FAM-TCATTAACTCTTCTCCATCCATTTCC转基因豆、棉豆是内源基因RbcS4-QF:CCACTCCACCATCACACARbcS4-QR:GGAGAGGTGTTGAGACCCRbcS4-QP:ACGTGGCATTATTCCAGCGGTDAS402785’DAS40278-QF:CACGAACCATTGAGTTADAS40278-QR:TGGTTCATTGTATTCTGDAS40278-QP:CGTAGCTAACCTTCATTGTANPTⅡqNptF63:CTATGACTGGGCACqNptR163:CGGACAGGTCGqNptFP90:CTGCTCTGATGCCGCCNPTⅡNPTⅡ-QF:AGGATCTCGTCGTGACCCATNPTⅡ-QR:GCACGAGGAAGCGGTCANPTⅡ-QP:FAM-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-BHQ1花、玉米、甜菜、番qHptF286:CAGGGTGTCAqHptR395:CCGCTCGTCTqHptFP308:TGCCTGAAACCGAACTBAR-QF:ACAAGCACGGTCBAR-QR:ACTCGGCCGTCCBAR-QP:FAM-CCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAG米、小麦、棉花、水等PAT-QF:GTCGACATGTCTPAT-QP:FAM-TGGCCGCGGTTTGTGATATCGTT1米、大等GOX-QF:GTCTTCGTGTTGCTGOX-QP:FAM-TGCTCACGTTCTCTACAC等因CP4-EPSPS-QF:GCAAATCCTCCP4-EPSPS-QR:CTTGCCCGTATTCP4-EPSPS-QP:FAM-TCATGTTCGGCGGT1豆、玉米、棉薯、甜等CTP2-CP4-EPSPS-QF:GGGATGACGTTAACTP2-CP4-EPSPS-QR:GGCTGCTTGCTP2-CP4-EPSPS-QP:FAM-CACGCCGT转基因豆、棉Cry3A-QR:CCATAGATTTGACry3A-QP:FAM-ACCTATGCTCAAGCTGC转基因铃薯等因CryⅠA(b)-QF:CGCGACTGGATCryⅠA(b)-QR:TGGGGAACAA(b)-QP:FAM-CCGCCGCGAGCTGACCCTGACCGT等因CRYⅠA(c)-QF:CGGAAATGCGTACRYⅠA(c)QR:TTCTGGACTA(c)QP:FAM-ACATGAACAGCGCCTTGACCACAG1转基因因CRYⅠA(c)-QF:GACCCTCACAGTTCRYⅠA(c)-QR:ATTTCTCTGGTAAA(c)-QP:FAM-TCCCGAACTATGACTCCAGA转基因PMI-QF:CCGGGTGAATCAGPMI-QP:FAM-TGCCGCCAACGAATCACCGGpRice-EactinpRice-Eactin-QF:TCGAGGTCATTCATATGCTTGpRice-Eactin-QR:TTTTAACTGATGTTTTCACTpRice-Eactin-QP:FAM-AGAGAGTCGGGATAGTCCA转基因大米是因Bt-F2:GGGAAATGCGTATTCABt-R2:TTCTGGACTGCGABt-P2:ACATGAACAGCGCCTTGACBt-F3:GACCCTCACAGTTTTGGABt-R3:ATTTCTCTGGTAAGTTGGBt-P3:TCCCGAACTATGACTCCAGAACCTACUbiquitinubiquitin-QF:GTCCAGAGGCAGCGACubiquitin-QR:CGAGTAGATAATGCCAGCCTubiquitin-QP:TGCCGTGCCGTCTGCTTCGCTpUbi-QF:GAGTAGATAATGCCAGCCTGTTpUbi-QR:ACGCGACGCTGCTGpUbi-QP:FAM-CGTCGACGAGTCTAACGGACACCAAC转基因玉米是因pSSuAra-QF:GGCCTAAGGAGAGGTGTpSSuAra-QR:CTCATAGATAACGATAAGATTCATTpSSuAra-QP:FAM-CCTTATCGGCTTGAACCGCTG转基因拟南芥是内源pTA29pTA29-QF:GAAGCTGTGCTAGAGAAGATGTTTpTA29-QR:GCTCGAAGTATGCACATTTAGCpTA29-QP:FAM-AGTCCAGCCACCCACCTTATGCAA烟草是因tOCS-QF:CGGTCAAACCTAAAAGACTGtOCS-QR:CGCTCGGTGTCGTAGtOCS-QP:FAM-TCTTATTCAAATTTCAAAAGTGCCtg7-QF:ATGCAAGTTTAAATTCAGAAATATTtg7-QR:ATGTATTACACATAATATCGCACTCtg7-QP:FAM-ACTGATTATATCAGCTGGTACATTBt11-QF:TGTGTGGCCATTTATCBt11-QR:CGCTCAGTGGAACGABt11-QP:FAM-TTCCATGACCAAAATCCCTTATC1507-QF:TAGTCTTCGGTC1507-QR:CTTTGCCAAGTC1507-QP:FAM-TAACTCAAGGCCCTCACTCAMON863-QF:GTAGGATCGGAAAGCTMON863-QR:TGTTACGGCCTAAATGCMON863-QP:FAM-TGAACACCCATCCGAAMON88017-QF:GAGCAGGACCTGCAGMON88017-QR:TCCGGAGTTGACCMON88017-QP:FAM-TCCCGCCTTCAGTTTANK603-QF:ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAANK603-QR:AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACTNK603-QP:FAM-TGGTACCACGCGACACACTTCCACTC-GA21-QF:CGTTATGCTATTTGCAACTGA21-QP:FAM-TTTCTCAACAGCAGGTGGGAMRABt176-QF:GGCCGTGAACGAGBt176-QR:GGGAAGAAGCCTACATGTTTBt176-QP:FAM-AGCAACCAGATCGGCCGACACC-AMON810-QF:TCGAAGGACGAAGGACTCTMON810-QR:GCCACCTTCCTTTTCCAMON810-QP:FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCT25-QF:ACAAGCGTGTCGT25-QR:GACATGATACTCCT25-QP:FAM-TCATTGAGTCGTTCCGCCATCBH351-QR:CTAGAAGGCAATTCCBH351-QP:FAM-GTCGACCTGCAG59122-QF:GGGATAAGCAAG59122-QR:CCTTAATTCTCCG59122-QP:FAM-TTTAAACTGAAGGCMIR604-QF:GCGCACGCAATMIR604-QR:GGTCATAACGTGACTCCCTTMIR604-QP:FAM-AGGCGGGAAACGACAATCT3272-QF:TCATCAGACCAGATTC3272-QP:FAM-ACTGCTGACGCGGCCAAACALY038-QF:TGGGTTCAGTCTGCLY038-QR:AGGAATTCGATATCAAGCTLY038-QP:FAM-CGAGCGGAGTTTATGGGTCGAMON89034-QF:TTCTCCATATTGAMON89034-QR:CGGTATCTATAATACCGTGGTTTAMON89034-QP:FAM-ATCCCCGGAAATTATGTT-Q98140-QF:GTGTGTATGTCTCTTTG98140-QR:GATTGTCGTTT98140-QP:FAM-CTCTATCGATCCCCCTAAACT-TAMRAMIR162-QF:GCGCGGTGTCATCTATGMIR162-QR:TGCCTTATCTGTTGCCMIR162-QP:FAM-TCTAGACAATTCAGTACADAS40278-QF:CACGAACCATTGAGTTADAS40278-QR:TGGTTCATTGTATTCTGDAS40278-QP:FAM-CGTAGCTAACCTTCATTGTMON87460-QF:CACGTTGAAGGAAMON87460-QR:TCGCGATCCTCCTMON87460-QP:FAN-AGGGAGTATGTAGATAAATCC-2-QF:GTTTATGGTTCCC-2-QR:TCGGGGGATCTCC-2-QP:CACCCTTGTGCAATGGGCC0030.2.4-QF:GCGTCAATTTGTTTACC0030.2.4-QR:GGTACGCCAC0030.2.4-P:TATCCTTAGCACGCACATC0030.2.5-QF:GTCATTCCAATAGATTAGTCTC0030.2.5-QR:CGGTCCCGTTTC0030.2.5-P:CTGTCATTCTCATTGTGGTGZZM030-QF:GTCATCTATGTTACTAGATCGGZZM030-QR:AGATTCATGACAGGAAGATAAZZM030-P:CTATCAGTGTTTGACAG1105E-823C-QF:TAAGCGTCAATTTGTG1105E-823C-QR:GATCCCGACATAAACG1105E-823C-P:ACCGTGATAAACTCTTTCGTS40-3-2-QF:TTCATTCAAAATAAGATCAGTS40-3-2-QR:GGCATTTGTAGGGTS40-3-2-QP:FAM-CCTTTTCCATTTGGMON89788-QF:TCCCGCTCTAGCGCTMON89788-QR:TCGAGCAGGACCMON89788-QP:FAM-CTGAAGGCGGGAAACGDP305423-QF:CGTGTTCTCTTTTTGDP305423-QR:GTGACCAATGAATACATAACADP305423-QP:FAM-TGACACAAATGATTTTCDP356043-QF:GTCGAATAGGCTAGGTTTADP356043-QR:TTTGATATTCTTGGAGTAGATDP356043-QP:FAM-CTCTAGAGATCCGTCAAMON87705-QF:TTCCCGGACATGAAGCMON87705-QR:ACAACGGTGCCTTGGMON87705-QP:FAM-AAGAGACTCAGGGTGTTMON87701-QF:CGTTTCCCGCCTTCAGMON87701-QR:TGGTGATATGAAGATACATGCTMON87701-QP:FAM-TCAGTGTTTGACACACACCV127-QF:AACAGAAGTTTCCGTTCV127-QR:CATTCGTAGCTCGCV127-QP:FAM-TTTGGGGAAGCTGTCCCAMON87769-QF:CATACTCATTGCTGATCCATGMON87769-QR:GCAAGTTGCTCGTGAMON87769-QP:FAM-CCCGGACATGAAGCCAFG72-QF:AGATTTGATCGGGCTFG72-QR:GCACGTATTGATGACCFG72-QP:FAM-AATGTGGTTCATCCGTCTT-MON87708-QF:TCATACTCATTGCTGATCMON87708-QR:FAM-AGAACAAATTAACGAAAMON87708-QP:TCCCGGACTTTAGCTCAAAAAAMRALLRice62-QF:AGCTGGCGTAATALLRice62-QR:TGCTAACGGGTGCALLRice62-QP:FAM-CGCACCGATTATTTATALLRice601-QF:TCTAGGATCCGAAGCLLRice601-QR:GGAGGGCGLLRice601-QP:FAM-CCACCTCCCAACAATAA114-7-2-QP:FAM-CGGAAKefeng6-QF:GCTTGGATCAGATTKefeng6-QR:GTCAGATAAACTGATTG6-QP:FAM-CGACAAAAGATCAGGATTTGGGKefeng8-QF:ATATTCTGAAGTGKefeng8-QR:CGACCATGATGCT8-QP:FAM-CGTTATTTATGAGATGGKMD1-QF:TCCGCAATGTGTTATTAAGTKMD1-QR:CCGATATGCCTGKMD1-QP:FAM-CGTCAATTTGTTTACACCACMON531-QF:TCCCATTCGAGTTTMON531-QR:AACCAATGCCACCCMON531-QP:FAM-TTGTCCCTCCACTTCTTCTC-TMON1445-QF:GGAGTAAGACGATTCAGATMON1445-QR:ATCGACCTGCAGCCMON1445-QP:FAM-ATCAGATTGTCGTTTCCCMON15985-QF:GTTACTAGATCGGMON15985-QR:AAGGTTGCTAAAMON15985-QP:FAM-CCGCTCTAGACCTAGTGGMON88913-QF:GGCTTTGGCTACCTTAAMON88913-QR:CAAATTACCCATTAAGTAGCCCMON88913-QP:FAM-AACTATCAGTGTTTGACLLCotton25-QF:CAGATTTTTGTGGGATTLLCotton25-QR:CAAGGAACTATTCLLCotton25-QP:FAM-CTTAACAGTAC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