分子发光分析法

第五章分子发光分析法1分子发光基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。激发模式光致发光（荧光，磷光）热致发光场致发光化学发光2主要分析方法：荧光分析法(MolecularFluorescence)磷光分析法(MolecularPhosphorescence)化学发光分析法(Chemiluminescence)3§5.1荧光分析法一、概述分子荧光法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种方法16世纪，人们已经观察到了荧光现象1852年，Stokes考察了奎宁和叶绿素的荧光，对荧光现象给出了解释1864年，Stokes提出将荧光作为一种分析方法1867年，Goppelsroder应用铝－桑色素络合物的荧光测定了铝1924年，Wawwilous进行了荧光量子产率的测定1926年，Gavila对荧光寿命进行了测定4荧光分析法的特点灵敏度高

检出限通常比分光光度法低2-4个数量级选择性好

包括激发和发射两个过程，通过前后两次波长的选择，可得到更高的选择性方法简便快速，试样用量少对环境因素比较敏感，能产生强荧光的化合物相对较少，使其应用受到一定限制5二、基本原理6（一）荧光与磷光的产生过程1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…

；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…

；2.电子激发态73.激发态→基态的能量传递途径8

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转化外转移系间蹿越振动弛豫无辐射跃迁

激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大荧光：10-9～10-6

s,第一激发单重态的最低振动能级→基态磷光：10-4～100

s,第一激发三重态的最低振动能级→基态9S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间蹿越内转化振动弛豫能量l2l1l

3

外转移l

2T2内转化振动弛豫10S0S2S1T1吸光

1吸光

2荧光

3荧光荧光发射

处于第一激发单重态中的电子跃回至基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长λ3为的荧光。荧光的产生在10-9-10-6s内完成。

辐射能量传递过程11S0S2S1T1吸光

1吸光

2荧光

3磷光磷光磷光发射电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁过程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-4-100s。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。非辐射能量传递过程12振动弛豫内转化外转移系间蹿越13S0S2S1T1吸光

1吸光

2振动弛豫在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热

的形式发出。发生振动弛豫的时间为10-14-10-12s。14S0S2S1T1吸光

1吸光

2内转化当两个相同多重态的电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。处于高激发单重态的电子，通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。S0S2S1T1吸光

1吸光

215外转移外转移激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。16S0S2S1T1吸光

1吸光

2荧光

3系间蹿越系间蹿越

指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一种系间蹿越。通常，发生系间蹿越时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。

（二）荧光效率及其影响因素（1）荧光效率荧光效率用来描述激发态分子发生辐射跃迁返回基态的概率的大小，定义为发荧光的分子数目与激发态分子总数的比值。荧光效率(φf)＝发荧光的分子数／激发态分子总数φf越高，辐射跃迁的概率越大，发射的荧光越强具有分析应用价值的荧光化合物，φf应在0.1-1之间17（2）荧光与分子结构的关系物质必须能够吸收紫外-可见光，即分子中必须含有共轭双键这样的强吸收基团，共轭体系越大，π电子的离域性越强，越易被激发而产生荧光。共轭芳环增大，荧光效率提高，荧光峰向长波方向移动。 萘φf＝0.29,λem=310nm

蒽φf＝0.46,λem=400nm18b.分子的刚性平面结构有利于荧光的产生

荧光黄，φf接近1酚酞，没有荧光刚性平面结构可以减少分子振动和碰撞去活的可能性。有机配位剂与金属离子形成螯合物后荧光强度增大，也是由于形成了共平面的配合物的原因。19c.取代基的影响给电子基团(-OH,-NH2,-NR2,-OR)使共轭体系增大，导致荧光增强。反之，吸电子基团(-COOH,-NO,-NO2)使荧光减弱。“重原子效应”---随着卤素取代基原子序数的增加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。分子中由于重原子的存在导致容易发生系间窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加所致。20（3）环境因素对荧光的影响a.溶剂的影响电子激发态比基态具有更大的极性，溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。b.温度的影响辐射跃迁的速率不随温度而变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。T增大，φf减小21c.pH值的影响含有酸性或碱性取代基的芳香族化合物的荧光性质受pH值的影响大，共轭酸碱的光谱有明显差异，同时质子化会对π电子体系产生影响。d.表面活性剂的影响形成有序的胶束微环境，对激发单重态的分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。22e.溶解氧的荧光熄灭作用氧分子具有顺磁性（三重态），溶解氧的存在，使激发态单重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，因而会使荧光效率降低。另一种原因是处于基态的三重态能级的氧分子和激发单重态的荧光物质相碰撞，形成单重激发态的氧分子和三重态的物质分子，导致荧光熄灭。23（三）荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度If正比于吸收的辐射强度Ia与荧光量子产率φf

。

If=φf

Ia根据Beer定律Ia=I0-It=I0(1-e-

lc)I0和It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得If=φf

I0(1-10-

lc)=

I0(1-e-2.3

lc)24经近似处理，整理得：If

=2.3

f

I0lc当入射光强度I0

和l一定时，上式为：If

=Kc即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当lc0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。25荧光猝灭

荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。导致荧光猝灭的主要类型：①碰撞猝灭碰撞猝灭是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态，产生猝灭作用。M+hv→M*(激发)M*→M+hv’(发生荧光)M*+Q→M+Q+热(熄灭)26②静态猝灭由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变。

③转入三重态的猝灭分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。27④发生电子转移反应的猝灭

某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了电子转移反应，因而引起荧光猝灭。⑤荧光物质的自猝灭

在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。28（四）荧光的激发光谱和发射光谱绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可得到激发光谱曲线。荧光强度最大时的波长即为激发波长λex。荧光物质的激发光谱曲线与其紫外吸收曲线可能相同，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的。29如果固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可得到荧光或磷光发射光谱曲线。荧光强度最大时的波长即为发射波长λem30激发光谱与发射光谱的关系a）波长比较与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长，即产生所谓Stokes位移。（振动弛豫失活所致）b）形状比较荧光光谱形状与激发波长无关。尽管分子受激到可到达不同能级的激发态，但由于去活化（内转换和振动弛豫）到第一电子激发态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。31c.

镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。3233三、荧光仪器第一单色器或滤光片记录仪第二单色器或滤光片荧光光源激发样品池为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及为将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二单色器。荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。341）光源：强度大、适用波长范围宽；常用光源有氙灯、高压汞灯2）样品池：低荧光的材料；常用石英，形状以方形和长方形为宜3）单色器：

滤光片、分光器4）检测器：光电管、光电倍增管35荧光分析的特点

灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001g/mL之间。

选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。

结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。

应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。36四、荧光分析法的应用

1、无机分析无机化合物的荧光分析法有三类：（1）直接法：利用金属离子或非金属离子与有机荧光试剂形成能发出荧光的络合物，在紫外光的辐射下测量络合物所发射的荧光强度进行定量用此法测定的元素已有七十多种。（2）荧光猝灭法：有些无机离子不能形成荧光络合物，但它可以从金属-有机试剂荧光络合物中夺取金属离子或有机试剂，形成更稳定的络合物或难溶化合物，使荧光强度降低。（3）催化荧光法：无机离子形成荧光络合物的速度很慢或产生的荧光微弱，在微量金属离子催化作用下反应迅速进行，可由在给定时间内测定的荧光强度增强程度来测定该金属离子的浓度；相反，某些微量金属离子可阻止荧光物质的生成或促使荧光物质转化为非荧光物质，根据荧光熄灭效应测量在给定时间内荧光强度的降低程度测定该金属离子的浓度。２、有机分析（１）脂肪族化合物（２）芳香族化合物（３）在生物化学、生理医学和临床、药物分析中有广泛应用3738荧光试剂：绝大多数为芳香族化合物，含两个以上官能团，与金属离子形成五元或六元环螯合物，使分子刚性平面结构增大。荧光试剂应满足以下要求：(1)与分析物质快速定量反应(2)形成稳定的强荧光物质(3)试剂本身无荧光或与产物的荧光光谱能分开(4)生成的荧光络合物的激发和发射光谱不存在明显重叠。§5.2磷光分析法分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光是第一激发单重态的最低能层，经系间跨越跃迁到第一激发三重态，并经振动弛豫至最低振动能层，然后跃迁回到基态发生的。39S0S2S1T1吸光

1吸光

2荧光

3磷光与荧光相比，磷光具有如下三个特点：(1)磷光辐射的波长比荧光长分子的T1态能量比S1态低(2)磷光的寿命比荧光长由于荧光是S1

S0跃迁产生的，这种跃迁是自旋许可的跃迁，因而S1态的辐射寿命通常在10-9~10-6s，磷光是T1

S0跃迁产生的，这种跃迁属自旋禁阻的跃迁，其速率常数要小，因而辐射寿命要长，大约为10-4~100s(3)磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子敏感40磷光很容易受其它辐射或无辐射跃迁的干扰而使其强度减弱，甚至完全消失。因此，为了获得较强的磷光，宜采取下列措施：1.增加试样的刚性这种方法可减小质点间的碰撞几率，以减小无辐射跃迁。低温磷光就是基于这一原理建立起来的。通常，将被分析试样的乙醚或异戊醇溶液置于液氮中，让其冷冻至玻璃状后，即可进行磷光测定。412.固体磷光法此法基于测量室温下吸附于固体基质上的有机化合物所发射的磷光。所用的载体种类较多，有纤维素载体（如滤纸、玻璃纤维）、无机载体（如硅胶、氧化铝）以及有机载体（如乙酸钠、聚合物、纤维素膜）等。理想的载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加其刚性，并能减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷光背景。3.分子缔合物的形成在试液中，表面活性剂与被测物质形成胶束缔合物后，可增强其刚性，减小因碰撞而引起的能量损失。4.重原子效应在含有重原子的溶剂如碘乙烷和溴乙烷中，有利于系间蹿跃这种方式，因而有利于S1→T1跃迁，使磷光得到增强。磷光分析仪

磷光分析仪由光源、激发光单色器、液槽、发射光单色器、检测器等组成。它与荧光计的主要区别在于：液槽为了能在低温下测定磷光，盛试样溶液的石英液槽需要放置在盛液氮的石英杜瓦瓶内。磷光镜由于发生磷光的物质常伴随有荧光产生，为了区别荧光和磷光，常采用一种叫磷光镜的机械切光装置，利用荧光和磷光寿命的差异消除荧光干扰。44磷光分析法的应用磷光分析法与荧光分析法相互补充，在药物分析、临床分析及环境分析中得到了一定的应用。主要用于测定有机化合物，如石油产品、多环芳烃、农药、药物等方面。45§5.3化学发光分析某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。化学发光是由高能量、不放热、不做电功或其它功的化学反应所释放的能量激发体系中某种化学物质分子而产生的次级光发射。化学发光发生于生物体系则被称为生物发光。利用化学发光现象而建立起来的分析方法即为化学发光分析。46化学发光分析的特点：1、灵敏度高2、测定的线性范围宽：5－6个数量级3、仪器设备简单没有激发光源，因而无杂散光和背景干扰检测发光总量，因而不需要单色器4、分析速度快局限性：1、可供发光用的试剂有限2、发光机理有待进一步研究47一、基本原理1、化学发光反应的基本条件A＋B→C*

＋DC*→C＋hν能够产生化学发光的反应必须具备下述条件：（1）能快速地释放出足够的能量在可见光区能观察到化学发光，需要170~300kJ/mol的激发能（2）反应途径有利于激发态产物的生成（3）激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态，或能够将其能量转移给可以产生辐射跃迁的其它分子482、化学发光效率和发光强度化学发光效率φCL定义为：φCL=发射的光子数／参加反应的分子数=φr•φfφr－激发态分子的化学效率；φf－激发态分子的发光效率φr=激发态分子数／参加反应的分子数φf=发射