DB15T+3359-2024绵羊体外胚胎生产技术规程

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB44内蒙古自治区地方标准DB15/T3359—2024绵羊体外胚胎生产技术规程Technicalcodeoninvitroembryoproductioninsheep2024-02-232024-02-232024-03-23内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/T3359—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古赛诺种羊科技有限公司。IIDB15/T3359—2024绵羊体外胚胎生产技术规程范围本文件规定了绵羊体外胚胎生产过程中的卵母细胞体外成熟、体外受精和早期胚胎体外培养等内容。本文件适用于绵羊体外胚胎生产程序。（NY/T1571羊胚胎移植技术规程下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本文件。体外成熟invitromaturation（IVM）卵母细胞在体外恢复减数分裂并发育到第二次减数分裂中期（MII）这一过程，经历细胞核成熟和细胞质成熟。体外受精invitrofertilization（IVF）哺乳动物的精子和卵子置于适宜的培养条件下使之完成受精的一种技术。体外培养invitroculture（IVC）将受精卵置于适宜的培养条件下使其发育至囊胚期。4体外胚胎生产培养液配制采卵液、体外成熟培养液（IVM液）、受精液（IVF液）和胚胎发育液（IVC液）配方见附录A。5操作前准备1DB15/T3359—202420min30min756卵母细胞体外成熟拣卵针用酒精灯将采卵用玻璃管拉制成口径适宜的捡卵针，管口在火焰上烧圆钝。35mm10µL3.5L，52h检卵3760mm35mm37体外成熟7体外成熟15/100µL～20/100µL化碳培养箱培养22h～24h。培养条件：5%CO2、95%空气、38.6℃、饱和湿度。8卵母细胞体外受精准备工作5%（IVF）2h～3h；38.6℃预热0.2%的透明质酸酶工作液。体外受精选择体外受精效果好的精液，并根据体外成熟卵母细胞的数量计算所需的精液量。如使用冷冻精液，将所需精液置于37℃～40℃水浴解冻。取约3µL精液置于载玻片上，盖上盖玻片后，显微镜下检查精子活力和密度。2DB15/T3359—20248.2.4精子上游37100µL500µL38.65%CO230min。卵母细胞处理22h～24h0.22～3350/500µL～60/500µL（15/100µ～20枚/100µL受精液的密度移入受精液中。体外受精230min200µL～300µL1500r/min4min30µL～50µL1106/mL～1107个/mL38.6℃、5%CO20h。29体外培养20hIVC20hIVCIVC3）50/500µL～60/500µLIVC（）15/100µL～20/100µLIVCIVC90%N2、5%O2、5%CO2、38.6℃、饱和湿度。胚胎发育鉴定48h（）168h10记录（态，将其分为A、B、C级）、退化卵数（胞质不均匀、卵丘扩散严重、裸卵数）；记录卵母细胞成熟时间、培养的卵母细胞数量、卵丘扩展情况、卵裂率、囊胚率。3DB15/T3359—2024附录A（资料性）体外胚胎生产培养液配制20.02IU/mLFSH、0.02IU/mLLH、1µg/mLE、0.1mmol/L半胱胺、10-7mol/L褪黑素、10%FBS、0.1ml青链霉素合剂，使用TCM-199培养基定容至10mL，混匀后用Millipore0.22µm的过滤器过滤，在0℃～5℃条件下可保存2周。20.05gBSA、0.035g肝素钠、0.5mL青链霉素合剂，使用PBS定容至50mL，混匀后用Millipore0.22µm的过滤器过滤，在0℃～5℃条件下可保存2周。SOF3.1452gNaCl、0.2675gKCl、0.0814gKH2PO4、0.0442gMgSO4、0.2655g丙酮酸钠、1.3115gCaCl2、0.0251g肌醇、0.0074g谷氨酰胺、300µL乳酸钠、0.5mL青链霉素合剂、1%酚红，使用胚胎水定容至50mL，混匀后用Millipore0.22µm的过滤器过滤，在0℃～5℃条件下可保存2周。(IVF1mL发情羊血清、6IU/ml肝素钠,使用SOF液定容至50mL，混匀后用Millipore0.22µm的过滤1mL发情羊血清、6IU/ml肝素钠,使用SOF液定容至50