DNA测序技术的发展进程

DNA测序技术的发展进程一、本文概述本文旨在深入探讨DNA测序技术的发展进程，从早期的Sanger测序法到现代的下一代测序（NextGenerationSequencing，NGS）技术，再到最新的单分子测序技术，概述这些技术的基本原理、发展历程以及对生物学和医学领域产生的深远影响。我们将从技术的角度出发，分析这些测序方法如何提高测序速度、降低成本，以及提高测序数据的准确性和分辨率。我们还将探讨这些技术的发展如何推动基因组学、疾病研究、药物研发和个性化医疗等领域的发展。通过本文的阐述，读者将能够全面了解DNA测序技术的发展历程和现状，以及未来可能的发展趋势和挑战。二、第一代DNA测序技术在20世纪70年代末至90年代初，随着分子生物学和生物化学的飞速发展，人类迎来了第一代DNA测序技术——双脱氧终止法，也被称为桑格测序法（Sangersequencing）。这项技术由弗雷德里克·桑格（FrederickSanger）于1977年首次提出，并因此获得了1980年的诺贝尔化学奖。双脱氧终止法测序的基本原理是在DNA合成过程中，使用四种不同的双脱氧核苷酸（ddNTP）代替正常的脱氧核苷酸（dNTP）。当DNA聚合酶遇到双脱氧核苷酸时，由于其3'端缺少羟基，无法形成磷酸二酯键，因此DNA链的合成会在此处终止。通过对终止在不同位置的DNA片段进行电泳分析，可以确定待测DNA序列中各个碱基的位置和顺序。第一代DNA测序技术以其高准确性、高灵敏度和相对低廉的成本，为基因组学、转录组学和蛋白质组学等领域的研究提供了强大的支持。然而，由于其测序速度较慢、通量较低，使得大规模基因组测序变得耗时且成本高昂，因此急需一种更高效、更快速的测序技术来满足日益增长的研究需求。随着科技的进步，第二代和第三代DNA测序技术应运而生，它们在测序速度、通量和成本等方面都有了显著的提升，为生命科学研究和医学诊断等领域带来了革命性的变革。然而，第一代DNA测序技术作为开创性的里程碑，其历史地位仍不可撼动。三、第二代DNA测序技术在21世纪初，第二代DNA测序技术，也被称为下一代测序（Next-GenerationSequencing，NGS）技术，开始崭露头角。这项技术革命性地降低了测序成本，提高了测序速度，使得大规模的基因组测序成为了可能。第二代测序技术的代表有Illumina的Solexa技术、ABI的SOLiD技术和454LifeSciences的焦磷酸测序技术等。Illumina的Solexa技术：Solexa技术是基于边合成边测序的原理，通过可逆性末端终止和桥式PCR扩增，实现了高通量的并行测序。这种技术具有测序速度快、准确性高、成本低等优点，广泛应用于基因组重测序、转录组测序、小RNA测序等多个领域。ABI的SOLiD技术：SOLiD技术采用四色荧光标记寡核苷酸进行连续的连接反应，通过颜色编码识别碱基序列。这种技术具有长读长、高分辨率和高准确性的特点，适用于基因组结构变异、甲基化等研究。454LifeSciences的焦磷酸测序技术：焦磷酸测序技术是基于焦磷酸测序反应的原理，通过检测焦磷酸释放过程中的光信号来识别碱基序列。这种技术具有测序速度快、读长长、无需PCR扩增等优点，特别适用于宏基因组学、微生物组学等领域的研究。第二代DNA测序技术的出现，极大地推动了基因组学研究的进步。它不仅降低了测序成本，提高了测序效率，还使得大规模的基因组测序和重测序成为了可能。第二代测序技术也为转录组学、表观遗传学、微生物组学等多个领域的研究提供了强有力的工具。随着技术的不断发展和完善，第二代DNA测序技术将在生命科学研究中发挥更加重要的作用。四、第三代DNA测序技术第三代DNA测序技术，又称为下一代测序技术（NextGenerationSequencing，NGS），是在第二代测序技术的基础上进一步发展而来的。与前两代技术相比，第三代测序技术以其更高的通量、更低的成本和更高的准确性，正在引领DNA测序技术进入一个新的时代。第三代测序技术的核心在于单分子测序，它能够在单个DNA分子上进行测序，从而消除了PCR扩增的需要，避免了由此产生的偏差和错误。这种技术通常使用纳米孔或单分子荧光成像等方法，对DNA分子进行直接的测序。纳米孔测序是一种代表性的第三代测序技术，它利用电场驱动DNA分子通过纳米尺度的孔洞，同时监测通过孔洞的离子电流变化，从而推断出DNA序列信息。这种技术具有高通量、长读长和低成本等优点，能够实现对基因组、转录组和表观组等复杂生物样本的大规模测序和分析。单分子荧光成像测序则是另一种重要的第三代测序技术，它通过在单个DNA分子上标记荧光染料，然后利用高灵敏度的显微镜对荧光信号进行捕捉和解析，从而得到DNA序列信息。这种技术具有极高的准确性和灵敏度，能够实现对单个DNA分子的精确测序。随着第三代测序技术的不断发展，其在基因组学、转录组学、表观组学、微生物组学等领域的应用也越来越广泛。未来，随着技术的进一步成熟和成本的降低，第三代测序技术有望在生物医学、生物信息学、农业科学等领域发挥更大的作用，推动人类对生命科学的认识进入一个新的阶段。五、未来展望DNA测序技术，作为现代生物学和医学领域的重要支柱，自其诞生以来已经取得了显著的进步。然而，随着科学技术的日新月异，这一领域仍充满了无限的可能性和挑战。展望未来，我们可以预见DNA测序技术将在多个方面实现突破性的进展。测序速度和准确性的进一步提高将是未来研究的重点。随着新一代测序技术的不断发展和优化，我们可以期待更短的时间内完成更复杂的基因组测序任务，同时保证结果的准确性。这将极大地推动基因组学研究的进步，使得科学家们能够更深入地理解生命的奥秘。随着大数据和人工智能技术的发展，DNA测序数据的处理和分析能力将得到极大的提升。通过构建更高效的算法和模型，科学家们将能够更快速地挖掘出基因组数据中的有用信息，从而加速生物医学研究的进程。DNA测序技术在临床应用中的拓展也是未来的重要发展方向。例如，通过精准医疗和个性化治疗的实现，DNA测序技术可以帮助医生更准确地诊断疾病，并制定出更加有效的治疗方案。同时，随着基因编辑技术的发展，DNA测序技术也将在遗传病治疗和生物育种等领域发挥更加重要的作用。然而，技术的发展也带来了伦理和隐私等方面的挑战。如何在保证科学进步的保护个人隐私和数据安全，将是未来需要面对的重要问题。因此，加强相关法规的制定和执行，以及推动跨学科的合作与交流，将对于推动DNA测序技术的健康发展具有重要意义。DNA测序技术作为现代生物技术的核心之一，其未来的发展前景广阔而充满挑战。通过不断创新和合作，我们有信心在不久的将来实现更多的科学突破，为人类的健康和福祉做出更大的贡献。六、结论随着科技的飞速发展，DNA测序技术已经从最初的Sanger测序法发展到如今的高通量测序技术，为生命科学研究和医学诊断带来了巨大的变革。本文详细回顾了DNA测序技术的发展进程，从早期的双脱氧测序法到新一代测序技术的广泛应用，每一次技术的突破都极大地推动了我们对生命科学的理解和认知。在过去的几十年里，DNA测序技术的进步不仅提高了测序的速度和准确性，还降低了成本，使得大规模基因组测序成为可能。这一发展进程不仅促进了基础科学研究，还为临床诊断和治疗提供了强有力的支持。例如，通过全基因组测序，科学家们能够更深入地了解疾病的发病机理，从而为疾病的治疗和预防提供新的思路和方法。未来，随着技术的不断创新和完善，DNA测序技术将继续在生命科学研究和医学领域发挥重要作用。我们期待着新一代测序技术在基因组学、转录组学、表观遗传学等领域的应用，为揭示生命奥秘和改善人类健康做出更大的贡献。我们也需要注意到，随着测序技术的普及和应用范围的扩大，数据的安全性和隐私保护等问题也日益凸显，这需要我们不断完善相关法规和规范，确保技术的健康发展。DNA测序技术的发展进程是一个充满挑战和机遇的历程。它不仅推动了生命科学研究的进步，也为人类健康的改善提供了有力支持。我们有理由相信，在未来的日子里，DNA测序技术将继续在生命科学领域发挥重要作用，为人类创造更加美好的未来。参考资料：DNA测序技术，也被称为基因测序，是指通过生物化学方法，对DNA分子的碱基序列进行测定和解读。自20世纪70年代初，DNA测序技术已经经历了重大的发展，并持续地在生命科学、医学、生物技术等领域发挥关键作用。20世纪70年代，美国科学家FrederickSanger和他的团队发展出了第一代DNA测序技术——双脱氧法。这种技术的核心是通过识别放射性标记的双脱氧核苷酸，确定DNA序列中的特定位置。虽然双脱氧法测序技术取得了重要的生物学发现，但其操作复杂，且需要大量的时间和人力。第二代DNA测序技术：聚合酶链式反应（PCR）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）在20世纪90年代，随着聚合酶链式反应（PCR）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）的普及，第二代DNA测序技术得以快速发展。这些技术的出现使得DNA片段可以在体外进行大量复制，从而提高了测序的精度和效率。进入21世纪，随着下一代测序（NGS）技术的出现，DNA测序进入了一个全新的阶段。NGS技术采用了大规模并行测序的方法，可以在一次实验中同时测定大量的DNA序列。这种技术大大缩短了测序时间，并显著降低了成本。美国在DNA测序技术的发展上一直处于领先地位。从双脱氧法到下一代测序（NGS），许多重要的技术和设备都是由美国的研究团队开发的。同时，美国政府对生物技术的投入巨大，也极大地推动了DNA测序技术的发展和应用。尽管各个国家和地区都有自己的DNA测序技术和研究团队，但是国际合作已经成为一种趋势。国际合作的加强，不仅有助于共享资源和技术，还可以促进标准的统一和提升。例如，国际人类基因组计划就是一个成功的国际合作范例，它推动了人类基因组的全面解析。随着DNA测序技术的不断进步和应用范围的扩大，其在临床诊断和治疗上的应用也日益显著。基因组学和精准医学的发展使得我们可以从基因层面理解疾病的发生和发展，从而为患者提供更精确的治疗方案。DNA测序技术的发展历程展示了人类在生命科学领域的技术创新和进步。从最初的放射性标记双脱氧法到现在的下一代测序技术，我们已经可以更深入地理解和应用生命的本质。而这种技术的进步不仅在基础科学研究上发挥了重要作用，也在临床医学等领域产生了深远的影响。在全球范围内，越来越多的国家和团队正在投入到这个领域的研究中，推动着DNA测序技术的进一步发展和应用。DNA测序（DNAsequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）的排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。在基础生物学研究中，和在众多的应用领域，如诊断，生物技术，法医生物学，生物系统学中，DNA序列知识已成为不可缺少的知识。具有现代的DNA测序技术的快速测序速度已经有助于达到测序完整的DNA序列，或多种类型的基因组测序和生命物种，包括人类基因组和其他许多动物，植物和微生物物种的完整DNA序列。70年代末，WalterGilbert发明化学法、FrederickSanger发明双脱氧终止法手动测序，同位素标记80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，计算机图象识别人类基因组计划、基因芯片、个性化分子诊断、生物云计算……这些在21世纪第一个十年里吸引无数眼球的热门词汇，都和一个产业颇有渊源——DNA测序。生物技术和信息技术在这片创意新天地里水乳交融，如果用一句诗来形容坐拥两大技术护航的DNA测序产业，那就是——天生丽质难自弃。在业内人士眼里，DNA测序出身高贵，它破解基因密码(即碱基序列)，将基因组学与IT技术相结合，发展出一门新兴学科——生物信息学。以它为代表的基因技术，颠覆了传统生物学技术，引领生命科学未来发展潮流。以它为代表的基因工程，在医疗健康、环境保护、新能源、新材料、现代农业等热门领域大显身手。在业外人士眼里，DNA测序足够高科技，堪称“一项新技术衍生出一个新行业”的典范，在短时间内迅速成为国内外VC和PE的宠儿，发展速度之快以至于没有人能准确描绘出它十年后的发展蓝图。在日新月异的DNA测序技术面前，任何预测可能都显得保守。高科技领域就是这样一个诞生传奇的地方。DNA测序已从一项令人高山仰止的前沿技术迅速普及为生命科学常规技术。DNA测序成本下降的速度几乎可与电脑芯片运算能力增强的速度匹敌。DNA测序的发展不仅体现在成本的降低，更表现在高通量测序使得工作效率得到了大幅提高，这就为DNA测序产业化铺平了道路。在DNA测序商业化的浪潮下，我国《生物产业发展“十二五”规划》提出完成10000种微生物、100种动植物基因组测序、发现约500个新的功能基因、转化应用5个以上有重大经济价值的基因或蛋白。按照每种微生物进行“基因组完成图”测序的费用为30-50万元来看，DNA测序带来的市场容量达千亿元，这还仅仅是DNA测序商业应用市场的冰山一角。化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰，修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。高通量测序技术（High-throughputsequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation"sequencingtechnology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模并行签名测序（MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS）、聚合酶克隆（PolonySequencing）、454焦磷酸测序（454pyrosequencing）、Illumina(Solexa)sequencing、ABISOLiDsequencing、离子半导体测序（Ionsemiconductorsequencing）、DNA纳米球测序（DNAnanoballsequencing）等。由LynxTherapeutics公司在90年代发展的MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS技术是“下一代”测序技术发展的先驱。MPSS是一种基于磁珠（bead）和接头（adaptor）连接和解码的复杂技术，测定结果短，多用于转录组测序，测定基因表达量。MPSS测定结果有序列偏好性而易丢失DNA中某些特定序列，且操作复杂，已逐渐淡出，被新的方法替代。2005年哈佛GeorgeChurch实验室发展起来的，基于乳化PCR(emulsionPCR)和自动显微镜等技术的测序方法。相关技术已整合进ABI公司的SOLiD测序技术平台。由454公司发展的并行焦磷酸测序方法。该方法在油溶液包裹的水滴中扩增DNA（即emulsionPCR）,每一个水滴中开始时仅包含一个包被大量引物的磁珠和一个链接到微珠上的DNA模板分子（控制DNA浓度出现的大概率事件）。将emlusionPCR产物加载到特制的PTP板上，板上有上百万个孔，每个微孔只能容纳一个磁珠。DNAPolymerase在将一个dNTP聚合到模板上的时候，释放出一个PPi（焦磷酸分子）；在ATP-Sulfurylase（ATP硫酸化酶）催化下，PPi与APS生成一个ATP分子；ATP分子在Luciferase（荧光素酶）的作用下，将luciferin（荧光素）氧化成oxyluciferin，同时产生的可见光被CCD光学系统捕获，获得一个特异的检测信号，信号强度与相应的碱基数目成正比。通过按顺序分别并循环添加四种dNTP，读取信号强度和发生时间，实现DNA序列测定。这一技术的读长和每一碱基耗费都介于Sanger法测序和Solexa和SOLiD方法之间。454公司现下属于Roche公司。Solexa公司开发了一种可反转的染料终止法。DNA模板首先连接到与固体介质（如玻璃板）交联的引物上，并扩增形成本地微克隆。四种ddNTPs依次添加到体系中，未结合的ddNTPs在添加下一种核苷酸前被冲洗走。与454的焦磷酸测序不同，这种方法一次只延伸一个碱基。基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP6)和GeneScan胶(POP4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDyeMix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaqDNApolymeraseFS，反应缓冲液等。pGEM-3Zf(+)双链DNA对照模板2g/L，试剂盒配套试剂。M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，2μmol/L，即2pmol/μl，试剂盒配套试剂。DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为2g/L，即200ng/μl。引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成2μmol/L，即2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。3mol/L醋酸钠(pH2)称取8gNaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至2，定容至100ml，高压灭菌后分装。NaAc/乙醇混合液取5ml无水乙醇和5ml3mol/LNaAc混匀，室温可保存1年。取2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃离心30min，小心弃上清。加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。加入12μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。在PCR仪上进行热变性(95℃2min)，冰中骤冷，待上机。按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(2kV，20min)，在5kV下电泳2h。仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%。差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。SILVERSEQUENCETMDNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。SILVERSEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。TaqDNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级TaqDNA聚合酶是一种TaqDNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。SILVERSEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP（7-deazadGTP，或dITP）替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物（<500bp）得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。由于本系统采用热循环装置,与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要03～2pmol模板DNA，随模板种类而定。(2).在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA（dsDNA）模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板（如PCR反应产物）快速重退火所引起的问题。(3).高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺W/V，2%甲叉双丙烯酰胺W/V）：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml双蒸水中，定容至250ml，45mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。10%过硫酸铵，5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。10×TBE缓冲液（1mol/LTris，83mol/L硼酸，10mmol/LEDTA）：1gTris，35g硼酸，72gNa2EDTA·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为3。显影溶液：60g碳酸钠（Na2CO3）溶于2升超纯水中，使用前加3ml37%甲醛和40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml）。对于每组测序反应，标记四个5mleppendorf管（G、A、T、C）。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物（d/ddNTPMix）。各加入1滴（约20μl）矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。对于每组四个测序反应，在一个eppendorf管中混合以下试剂：在引物/模板混合物（以上第2步）中加入0ml测序级TaqDNA聚合酶（5μ/ml）。用吸液器吸动几次混匀。从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以【注意】中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。热循环程序完成后，在每个小管内加入3μlDNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。3000～5000bp（超螺旋质粒DNA）：4mg（2pmol）48000bp（λ,粘粒DNA）：1mg（31fmol）由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。dsDNA：1pmol=（6×10mg）×n，其中n为模板碱基对数ssDNA：1pmol=（3×10mg）×n，其中n为模板碱基数（3）为阻止TaqDNA聚合酶延伸非特异性退火引物，热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。95℃2分钟，然后：95℃30秒（变性），42℃30秒（退火），70℃1分钟（延伸）。95℃2分钟，然后：95℃30秒（变性），70℃30秒（退火/延伸）。银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高（棕色）。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。①在1ml95%乙醇，5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷（BindSilane），配成新鲜的粘合溶液。②用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板，整个板面都必须擦拭。③4～5分钟后，用95%乙醇单向擦玻璃板，然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程，每次均须换用干净的纸，除去多余的粘合溶液。①在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷，使凝胶不能很好地粘附。③防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的，否则将导致凝胶撕裂。②5～10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。①用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10%NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染，用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开，如果出现交叉污染，以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用2mm或4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%～8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至2ml，并用45mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4～6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。（3）胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。①使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。（5）按30V/cm的电压预电泳20～30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。①用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。②应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1～3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4～6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚4mm。厚度小于4mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40～60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长，2mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。①上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。②一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。固定凝胶：将凝胶（连玻璃板）放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没，充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜（不振荡）。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出，当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10～20秒，使水流尽。（1）在显影溶液中加入甲醛（3ml）和硫代硫酸钠溶液（400μl）以完成显影液的配制。（2）从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5～10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5～10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长，可重复第五步用染色液浸泡。（3）立刻将凝胶转移至1升（总量的一半）预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带，把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2～3分钟或直至所有条带出现。固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应，固定凝胶。在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景（如纸）上观察凝胶，若需永久保存的记录,则可用EDF胶片保留实验结果。测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响①水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水（NANOpureR或Milli-QR的水）或双蒸水可获得较好的效果，如果水中有杂质，则低分子量条带可能无法出现。②碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和KodakACS试剂级碳酸钠（FisherCat#S263-500或S262-3，或KodakCat#109-1990），一般可获得较好的结果。③色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA，产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。④如果凝胶厚度超过4mm或丙烯酰胺浓度高于4～6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比4mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。⑤在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10～12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。使用EDF胶片可增强测序条带的对比度，如果测序胶上条带很淡，我们建议把数据转移至EDF胶片，银染胶在其影像转移至EDF胶片之后可增强条带可读性。在暗室内，将染色过的粘于玻璃板的凝胶（胶面向上）置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板，亦可用白灯箱，为确保曝光时间，用一小条EDF胶片曝光不同时间，检查不同的曝光强度，一般曝光20～40秒可得较好结果。在红灯下找到EDF胶片有缺刻的一角，然后把胶片置于凝胶上，使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的，因此必须确保缺口在左上角。用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF胶片，可使用下列操作过程：①进行EDF胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作，以免印上指纹。同时注意EDF胶片不能用自动胶片处理器。②对于不同的光源最佳曝光时间可能不同，通过对一小条EDF胶片曝光不同时间以选择你所用光源的最佳曝光时间，参阅胶片说明书。③曝光时间短则EDF胶片影像较深，曝光时间长则有助于减弱背景。“鸟枪法”是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖