《实验猴寄生虫病防治技术规范》（征求意见稿）

ICS11.220CCSB4145在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。IDB45/TXXXX—XXXX II 12规范性引用文件 13术语和定义 14诊断方法 25防治要求 36驱治方法 47监测 48档案管理 6附录A（规范性）试剂的配制 7附录B（资料性）肠道溶组织内阿米巴特异性引物序列及检测结果图示 8附录C（规范性）常用寄生虫药防治药物及使用规定 10附录D（规范性）操作规范 10 12DB45/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由本标准由广西壮族自治区农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：广西壮族自治区兽医研究所。本文件主要起草人：谢永平、贺会利、冯世文、吴翠兰、陶立、李军、彭昊、钟舒红、马春霞。1DB45/TXXXX—XXXX实验猴寄生虫病防治技术规范本文件界定了实验猴寄生虫病防治涉及的术语和定义，规定了人工驯繁养殖实验猴寄生虫病的诊断方法、防治要求、驱治方法和监测等内容。本标准适用于广西行政区域内人工驯繁养殖实验猴寄生虫病的防治。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18448.2-2008实验动物弓形虫检测方法GB/T18448.7-2008实验动物疟原虫检测方法GB/T18448.9-2008实验动物肠道溶组织内阿米巴检测方法GB18596-2001畜禽养殖业污染物排放标准GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T27401-2008实验室质量控制规范动物检疫NY/T1168-2006畜禽粪便无害化处理技术规范NY/T1949-2010隐孢子虫卵囊检测技术改良抗酸染色法T/CALAS106-2021实验动物结肠小袋纤毛虫核酸检测方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实验猴laboratorymonkey由人工饲育，对其携带的微生物进行控制，遗传背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的动物。实验猴主要包括食蟹猴和猕猴。3.2寄生虫病parasitosis由动物界包括原生动物的各种寄生性的无脊椎物种（统称寄生虫）引起的疾病。3.3优势虫种superiorityparasite在一定地区，某一种动物所感染的寄生虫虫种当中，感染分布广、且危害严重的主要寄生虫虫种。3.4蠕虫病helminthosis由吸虫、绦虫、线虫、棘头虫引起的寄生虫病。2DB45/TXXXX—XXXX3.5原虫病protozoosis由溶组织内阿米巴、结肠小袋纤毛虫、球虫、隐孢子虫等引起的寄生虫病。3.6体外寄生虫ectoparasite寄生于动物体外并暂时性吸取营养的寄生虫。如螨、虱等。4诊断方法4.1直接涂片法在载玻片上滴加一滴生理盐水，用竹签挑取少许被检实验猴新鲜粪便，或者用刀片刮下少许皮屑，将粪便或者皮屑在生理盐水中涂抹均匀，置于光学显微镜下检查，或解剖动物后立即用接种环挑取新鲜小肠、盲肠、结肠内容物或病变组织，分别与生理盐水混合涂成薄而均匀的薄膜，盖上盖玻片后于显微镜下检查。此方法适用于大多数虫卵检测。4.2水洗沉淀法取被检粪便10～15g于塑料杯中，加水20mL～30mL搅拌成混悬液，用60目铜筛过滤到100mL三角烧杯中，再加入适量蒸馏水充分搅拌混匀，静置15min，倒去上清液，向沉渣中再加入蒸馏水，调匀、静置15min。重复3～4次，直至上层液变清。最后倒去上清液，取沉渣涂片镜检。此方法适用于大多数虫卵检测。4.3卢氏碘液染色法取少许新鲜粪便或用吸管吸取4.2水洗沉淀法的量杯底部沉淀物1滴，加卢氏碘液工作液（按附录A进行）1滴，搅匀，盖上盖玻片后，在10×和40×光学显微镜下测量观察。此方法适用于溶组织内阿米巴、结肠小袋纤毛虫、鞭毛虫等原虫检测。4.4饱和蔗糖漂浮离心法取被检粪便5g～10g于塑料杯中，加入10mL～20mL自来水充分搅匀，经过60目铜丝筛过滤，滤液装入离心管中，3000rpm离心5min，弃上清，加入适量配置好的饱和蔗糖溶液（按附录A进行），充分搅拌，使下层沉淀和蔗糖液充分混匀，3000rpm离心5min～10min。用铁丝吊环蘸取表层液膜，涂于载玻片上，制片后于10×和40×光学显微镜下观察、测量。此方法适用于隐孢子虫、鞭虫的检测。4.5虫体浓集法取病料于试管内，加入10％氢氧化钠自热浸泡过夜或加热煮沸3min～5min，使皮屑溶解，虫体沉淀管内，静置20min，弃上清，吸取沉淀，涂于载玻片上，在10×和40×光学显微镜下测量观察。此方法适用于螨虫检测。4.6环介导等温扩增法取待检实新鲜粪便2.0g～5.0g，置灭菌烧杯充分搅匀，称取搅拌后的粪便样本100mg～300mg至2mL离心管中，按粪便基因组DNA提取说明书提取模板DNA。按照LAMP扩增反应试剂盒配制反应体系，将已配制好、分装完毕的反应试管置于实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)密闭进行，浊度仪实时监控扩增3DB45/TXXXX—XXXX情况，反应程序为63℃保持60min，之后85℃灭活5min。仪器通过读取反应管的浊度值绘制浊度曲线，在阴阳性对照成立的情况下，样品反应管出现浊度上升曲线的为可检测出其目的基因，判为阳性，反之为阴性。5防治要求5.1人员要求防控的技术人员要经过相关的技术培训，严格遵守操作规程，每年体检一次，做好人畜防护安全工作。5.2设施、设备要求药浴池要防渗漏，要求建在地势较低处，并远离人畜饮水水源。药浴、药淋设备应按操作要求使用。驱虫前、浴前、淋前要求先进行小群试验，确认安全后方可大群驱虫、药浴或药淋。5.3引进猴要求必须从外场引进猴群时，要确认产地为非疫区。引进后隔离饲养45d以上，进行观察、检疫、监测，并进行一次驱虫，收集粪便进行发酵处理。确认为健康后方可与健康猴混群。5.4药物使用要求药物配制、使用剂量和使用方法要严格按照使用说明书进行。要严格按照说明书执行休药期，对未规定休药期的药物，休药期不应少于28d。5.5饲养管理要求幼猴与成年猴应分开饲养，以减少感染机会。供给全价营养饲料，合理补充青料和必要的添加剂，增强猴只抵抗力。病猴应及时隔离治疗，严禁混群饲养，以防感染传播。5.6其他要求驱虫过程中，应跟踪观察，发现中毒、伤残猴应及时采取解毒等治疗措施，具体治疗措施按附录D进行。5.7驱虫药物的选择5.7.1药物的选择和使用必须符合《中华人民共和国兽药典》、《中华人民共和国兽药规范》、《兽药质量标准》（第一册）、（第二册）、《进口兽药质量标准》的相关规定。5.7.2所用兽药必须来自具有《兽药生产许可证》和产品批准文号的生产企业，或者具有《进口兽药许可证》的供应商。所用兽药的标签应符合《兽药管理条例》的规定。5.7.3选用的药物要符合高效、广谱、安全、价廉、使用方便的原则。5.7.4定期预防性驱虫，要选择对优势虫种均有效的药物，如一种药物不能满足要求，可以选择2种或2种以上药物同时使用，但要注意药物配伍禁忌，尽量选择长效驱虫药制剂。5.8圈舍灭虫及废弃物无害化处理5.8.1圈舍灭虫4DB45/TXXXX—XXXX定期在空舍条件下，对圈舍墙壁、地面、围栏、用具、饲喂工具等喷洒杀虫药，能进行火焰消毒的耐高温设施选用火焰消毒法，以杀灭圈舍内的寄生虫卵。可与投药、药浴、药淋同步进行对圈舍墙壁、地面、围栏、用具、饲喂工具等喷洒杀虫药或火焰消毒，也可以根据发病情况或具体情况随时进行。5.8.2废弃物无害化处理5.8.2.1圈舍内粪便要及时清除，粪便集中堆积发酵处理，利用生物热杀灭各种寄生虫和虫卵，达到消灭传染源，保障人畜健康及环境安全。粪便处理应符合NY/T1168的规定；污水处理符合GB18596的规定。5.8.2.2病猴尸体及废弃物按《病死及病害动物无害化处理技术规范》规定执行，严禁将未经处理的病猴尸体、废弃物直接喂犬或随地抛弃。6驱治方法6.1蠕虫病采用高效驱虫药每年全群驱虫，一年进行三次，第一次在春季（3～4月第二次在夏季（7～8月气温较高，猴群在室外运动频繁时期进行，第三次在秋冬季（11～12月）。常用防治药物及使用规定按附录C进行。6.2原虫病采用高效抗驱虫药每年全群驱虫，一年进行2～4次，春季（3～4月），秋季（9～10月），根据寄生虫的流行情况适当调整。常用防治药物及使用规定按附录C进行。6.3螨虫病发现病猴后及时隔离治疗，选择长效驱虫药，一年进行三次，分别在1月、3月、10月进行驱虫，至少用药2次，用药间隔7d～8d。常用防治药物及使用规定按附录C进行。7监测7.1抽样数量及比例猴群监测（以猴群为单位抽样数量为猴数量的510％,其中幼猴30种猴40青年（商品用）猴30％。对规模小于100只的猴群，抽样数量不应少于10只。7.2监测时间蠕虫及原虫在驱虫前1周内或驱虫后7d～15d内进行监测，对出售的商品猴群随时进行监测。螨虫等体外寄生虫在每年秋末春初，冬季高发季节监测。7.3监测方法蠕虫采用粪便检查孕卵节片、幼虫和虫卵的方法，对病死猴可采用全身性蠕虫学检查法；原虫采用直接直接涂片法、水洗沉淀法、卢氏碘液染色法、饱和蔗糖漂浮离心法等，其中溶组织内阿米巴可采用溶组织内阿米巴核酸检测方法（见附录B），结肠小袋纤毛虫按T/CALAS106-2021进行检测，弓形虫按5DB45/TXXXX—XXXX照GB/T18448.2进行检测，疟原虫按照GB/T18448.7进行检测；体外寄生虫采用直接检查法、虫体浓集法等。7.4监测指标及计算方法7.4.1防治（驱虫）密度防治（驱虫）密度按式（1）计算： 式中：M—防治（驱虫）密度；Q1—防治（驱虫）猴数；Y1—猴群总数量。7.4.2感染率感染率按式（2）计算：式中：G—感染率；Y2—感染某种虫的猴数量；Y3—抽检猴的数量。7.4.3虫卵（包囊）减少率虫卵（包囊）减少率按式（3）计算：式中：C—虫卵（包囊）减少率；Q2—驱虫前每克粪便中的虫卵（包囊）数；Q3—驱虫后每克粪便中的虫卵（包囊）数。7.4.4虫卵转阴数虫卵（包囊）转阴数按式（4）计算： 式中：Y—虫卵（包囊）转阴率；Y3—抽检猴的数量；Y4—转阴猴的数量。6DB45/TXXXX—XXXX7.5监测评价根据监测指标及计算结果，了解实验猴寄生虫流行情况，指导驱虫并对驱虫效果进行评价。8档案管理建立防治档案，档案记录内容包括防治数量、用药品种、使用剂量、环境与粪便无害化处理、发病率、病死率及死亡原因、诊治情况等。7DB45/TXXXX—XXXX（规范性）试剂的配制A.1卢氏碘液储存液配制方法按照GB/T18448.9-2001的规定进行配制。A.2卢氏碘液工作液配制方法取A.1储存液5mL，加入20mL生理盐水，混匀后储存于棕色玻璃瓶中，随用随取。A.3饱和蔗糖溶液配制方法按照NY/T1949-2010中附录A的规定进行配制。8DB45/TXXXX—XXXX（资料性）肠道溶组织内阿米巴特异性引物序列及检测结果图示B.1溶组织内阿米巴引物扩增的目的基因16SrRNA基因B.2溶组织内阿米巴外引物amb-F3：GGCGCGTAAATTACCCAAamb-B3：GCGTTTTAATCACAACAACTTB.3溶组织内阿米巴内引物amb-FIP：CCTTCAAGACATGCTTACGCACCAACAGATAGAAGAGGTAGTGACamb-BIP：GAGTAAGAAGCAAAGAGTCTTACGATTGGAGCTGGAATTACCGB.4溶组织内阿米巴环引物LB:AATCAATTGGAGGGCAAGTCTGB.5试剂B.5.1无Rnase去离子水的配制去离子水加入0.1％的DEPC(焦碳酸二乙酯)混合均匀，室温静置过夜，121℃高压灭菌15min，冷却备用。B.5.2粪便基因组DNA试剂盒用于粪便基因组DNA的提取试剂（北京康为世纪生物科技有限公司提供），或其他等效产品。B.5.3Loopamp。扩增反应试剂盒Loopamp。扩增反应试剂（荣研生物科技（中国）有限公司提供），或其他等效产品。B.5.4阳性对照用限制性内切酶HindⅢ消化λ噬菌体DNA后，取其片段（6.557bp）重组入质粒所得。B.5.5阴性对照阴性对照使用灭菌去离子水。B.6操作程序B.6.1待检样品DNA提取将粪便样本称取100mg～300mg至2mL离心管中，按粪便基因组DNA提取说明书提取模板DNA，获得50µLDNA。所提取的模板DNA，直接放入PCR管中进行后续反应或置-20℃保存备用。B.6.2LAMP样品反应体系配制9DB45/TXXXX—XXXXB.6.2.1LAMP样品反应体系2×反应缓冲液12.5µLBstDNA聚合酶1µLamb-F35pmolamb-B35pmolLB20pmolamb-FIP40pmolamb-BIP40pmol去离子水（DW）补足23µL。分装后，放入微量离心机中离心数秒（瞬时离心），以此作为预混溶液，配制好的预混溶液立即使B.6.2.2对照反应体系2×反应缓冲液引物溶液DNABstDNA聚合酶去离子水（DW）2.5补足23B.6.2.3预混溶液与样本溶液混合添加样本溶液（溶组织内阿米巴DNA）2µL，使总量达到25µL，对照反应中，阴性对照使用去离子水2µL，阳性对照使用阳性对照DNA2µL，合上盖子轻击使溶液充分混匀后瞬时离心。B.6.2.4上机检测将已配制好、分装完毕的反应试管置于实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)密闭进行，浊度仪实时监控扩增情况，反应程序为63℃保持60min，之后85℃灭活5min。B.6.3结果判定实时浊度仪实时监测反应扩增情况，仪器通过读取反应管的浊度值绘制浊度曲线，在阴阳性对照成立的情况下，样品反应管出现浊度上升曲线的为阳性结果，没有出现浊度上升曲线的为阴性结果(见图B.1)B.7LAMP检测结果图示LAMP检测结果见图B.1。图B.1肠道溶组织内阿米巴LAMP检测结果图DB45/TXXXX—XXXX（规范性）常用寄生虫药防治药物及使用规定表C.1给出了常用寄生虫药防治药物及使用规定。表C.1常用寄生虫药防治药物及使用规定寄生虫病名称选择的药物名称制剂用法与用量内服，一次量5～10）mg/kg体重内服，一次量3～5）mg/kg体重内服，一次量3～5）mg/kg体重内服，一次量10～20）mg/kg体重，连用（5~wormwood内服，一次量5～10）g，连用（5～10）d。或药浴、喷淋5～8）mg/LD.1检测过程中防止交叉污染的措施DB45/TXXXX—XXXXD.1.1采样和制样过程采样和制样工具，应清洗干净，121℃,15min～20min灭菌，一套清洁工具仅限于一个样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为灭菌一次性容器。D.1.2检测过程D.1.2.1PCR实验室应分出试剂准备区、样品制备区、产物扩增区、产物分析区。将模板提取、LAMP反应液配制、LAMP扩增及鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的操作流程应从“清洁区”到“污染区”单方向