微生物学基础知识

PAGEPAGE14GMP培训教材微生物学基础知识主编夏俊强北京宏马明泰生物科技有限公司编制第一章绪言药品卫生是药厂管理的一项重要工作内容，是药品制备过程中加强文明生产，保证成品质量，防止微生物污染的重要措施，也是实行GMP制度的具体保证。药品卫生主要论述药品微生物学方面的要求及达到要求所采取的措施与方法。药品不仅要具有确切的疗效，而且必须安全可靠，质量稳定，便于长期保存。当药品一旦被微生物污染后，在一定的条件下微生物就会生长繁殖，导致药品变质、腐败，使疗效降低或丧失，甚至可能产生一些对人体有害的物质，应用后，不仅不能达到预期的防治目的，而且往往会引起机体感染、发热，甚至产生中毒等不良反应。制药工程的现代化对药品卫生提出更高的要求。药品卫生作为保证药品质量的重要因素，正得到人们越来越广泛的重视。在制药过程中所涉及的每一个环节，都应当十分注意药品卫生的问题。对于直接注入机体，用于创口表面、眼部和外科手术的灭菌产品，如注射剂、眼用制剂、止血剂、人血浆制剂及血浆代用品等，应该不含有微生物，至少不得含有活的微生物，而对于一些口服的非灭菌产品，如合剂、糖浆剂、丸剂、颗粒剂、片剂等，虽然允许在一定范围内含有微生物，但不得有致病性微生物存在。为了使药品中不含或少含微生物，必须根据药品卫生的具体要求，针对药品生产过程中的每一环节，采取切实有效的综合措施，确保产品质量。因此，面对药品生产的现状，积极研究如何防止药品被微生物污染、如何抑制微生物在药品中的生长繁殖、如何杀灭或除去药品中的微生物等问题，并不断采用新技术新措施，对于药品质量的提高和制药工业的发展具有十分重要的意义。1.1什么是微生物微生物是指在光学显微镜或电子显微镜下才能看到的微小生物。一般细菌的大小介于0.2μm到几个μm之间，病毒只有20—300nm左右的大小，它们的结构亦较简单。微生物对外界环境适应性较强，能迅速吸收营养物质很快繁殖。微生物的种类繁多，在自然界分布很广。微生物学的任务是研究微生物在一定条件下的形态结构、生命活动及其规律、进化、分类以及人类、动植物、自然界相互的关系。本课程着重讨论与药品生产过程有关的微生物。1.2微生物的分类它们的种类很多，根据其结构分属于三个类型共八种。（1）非细胞型微生物：无细胞结构，个体极小，能通过细菌滤器，只能在活细胞内生长繁殖。病毒属此。（2）原核细胞型微生物：虽有细胞结构，但仅有原始核，无核膜和核仁，细胞器很少。细菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体属此。（3）真核细胞型微生物：有细胞结构，细胞核分化程度较高，有核膜、核仁、染色体，细胞质内有完整的细胞器。真菌属此。1．3微生物学发展史1．3．1我国古代对微生物及传染病的认识1．3．2微生物形态学时期1．3．3微生物生理学时期1．3．4免疫学萌芽时期1．3．5病毒的发现1．3．6化学治疗剂与抗生素的发现1．3．7现代微生物与免疫学第二章细菌的生物学特性2．1细菌的形态与构造细菌是一类具有细胞壁的单细胞生物,属于原核细菌型微生物。各种细菌在一定环境条件下，有相对恒定的形态和结构。了解细菌形态结构特点，对于鉴别细菌、诊断疾病和研究细菌的致病性与免疫性，都具有重要意义。2．1．1细菌的大小与形态细菌体积微小，通常以微米（简写为,等于1/1000mm）为测量大小的单位。一般需用显微镜放大几百倍才能看到。根据细菌的基本形态可将其分成三类：球菌、杆菌和弯曲状菌。（1）球菌：单个球菌呈球形或近似球形，直径约1根据细胞分裂的方向和分裂后排列方式又可分为：①双球菌：细菌在一个平面上分裂，分裂后两个成对排列，如脑膜炎球菌。②链球菌：在一个平面上分裂，后两面个成对排列，如脑膜炎球菌、淋病双球菌。③葡萄球菌：在多个平面上分裂，后菌体堆积呈葡萄状，如金黄色葡萄球菌。也有的球菌在两个或三个互相垂直的平面上分裂，并排列成四联球菌或八叠球菌。（2）杆菌：菌体一般呈直杆状，有的细长或稍弯曲。杆菌种类很多，大小形状很不一致。大杆菌如炭疽杆菌度约3-10um，中等大小的杆菌如大肠杆菌长约2-3um，小杆菌如流感杆菌长约0.7-1.5um.大多数杆菌两端钝圆，少数两端齐（如炭疽杆菌）。有的两端膨大呈棒状（如白喉杆菌）。杆菌多单独存在，有的也可成对或链状排列。（3）弯曲状菌：菌体呈弯曲状又叫螺形菌。①弧菌：菌体只有一个弯曲呈弧形，如霍乱弧菌。②螺菌：菌体有数个弯曲，较为坚韧，如鼠咬热螺菌。③弯曲菌：菌体有单个或多个弯曲，如空肠弯曲菌。细菌在适宜条件下，保持其固有的典型形态。当环境条件变化时，其形态可发生改变，可出现多形态或细胞壁缺陷菌。2．1．2细菌细胞的构造【细菌的基本构造】.是指各种细菌都具有的细胞结构。（1）细胞壁细胞壁主要功能①物质交换②保护作用③具抗原性（2）细胞膜细胞膜的主要功能①物质交换②生物合成③能量产生（3）细胞质其中含有多种酶系统，是进行新陈代谢的重要场所。细胞质内还有多种重要成分如：质粒、核蛋白体、内含小体、核质。【细菌的特殊构造】是指某些细菌所特有的构造。(1)荚膜有些细菌分泌粘液包围在细胞壁外面，形成肥厚的粘液层，称为荚膜。其主要功能：①保护作用与细菌致病性有关②抗原性③不容易着色（2）鞭毛许多细菌的表面具有细长弯曲的丝状物，称为鞭毛。鞭毛是细菌的运动器官（3）菌毛是存在于细菌表面纤细、短而直的毛状结构。化学成分主要是蛋白质。（4）芽胞是在一定条件下菌体形成多层膜质结构的圆形或卵圆形小体，称为芽胞。在适宜条件下，即被激活发芽生成新的菌体，一个芽胞只能再生长为一个菌体（一个细菌只能形成一个芽胞），故芽胞的生成不是细菌的繁殖方式。对具有繁殖能力的细菌通常称为繁殖体。2．1．3细菌形态学检查法原则细菌微小且透明，一般要染色经显微镜放大后，才清晰可见。目前细菌染色技术和光学显微镜观察，仍为细菌形态学检查最重要和普遍应用的方法。主要方法：（1）单染色法（2）革兰氏染色法（3）抗酸染色法（4）特殊染色法2．2细菌的生理本节的内容包括细菌的营养、代谢、生长繁殖等生理活动规律。2．2．1细菌的营养各种细菌的生理功能差别很大，因而各自的营养需要也不一致。一般需要营养物质有水、氮源、碳源、无机盐类、生长因子。2．2．2细菌生长繁殖的条件营养物质细菌生长繁殖所需营养物质如前述。此外，尚需其他一些条件。酸碱度大多数细菌最适酸碱度为PH6.8-7.2，此时酶活性较强，生长旺盛。个别细菌在碱性环境下生长良好，如霍乱弧菌。温度不同种类的细菌，如其最适生长温度相差较大。多数为嗜温菌（在15~40℃均能生长）。寄生在人体的细菌即以宿主体温（37℃）为适宜生长的温度，因此实验室采用37℃培养细菌。气体与细菌生长有关的气体主要是氧气和二氧化碳。一般细菌在代谢中产生的二氧化碳即可满足其需要。2．2．4细菌的生长繁殖细菌繁殖的方式与速度细菌通常以简单的二分裂方式行无性繁殖。在适宜条件下，多数细菌繁殖很快，每20~30min分裂一次（一代），菌数即增长一倍，经过18~24h后，可形成肉眼可见的群体。但细菌不可能始终保持这样的速度持续繁殖，因为受到营养物质的消耗或毒性代谢产物累积的限制，当培养到一定时间生长率即下降，以致完全终止。也有少数种类的细菌繁殖较慢，如结核杆菌增殖一代，约需18h。第三章微生物污染药品的途径及杀灭方法3.1污染药品的途径3.1.1药物原料主要是指植物类药材，这类药材不仅直接带有微生物和活螨，且有利于微生物和活螨生长繁殖。3.1.2各种辅助材料如水、蜂蜜、淀粉等常用辅料均存在一定数量的某种微生物。3.1.3制药工具如：药筛、粉碎机、混合机、制丸机、压片机及各种盛装药物的容器等均有可能带入微生物。3.1.4环境空气空气中含有许多微生物，尘埃越多微生物也越多，故需净化空气。3.1.5包装材料装药用的玻璃瓶、塑料瓶、塑料袋、包装纸等若不经消毒和处理，均有可能带入某些微生物。3．2灭菌方法自然界多种物理、化学、生物学因素可对细菌产生不同的影响。通常可利用其对细菌的不利因素，以达到消毒、灭菌和治疗的目的。灭菌是指用物理或化学方法杀灭物体上所有的微生物（包括致病的和非致病的、细菌繁殖体和芽胞）。消毒是指杀死物体上病原微生物的方法，但不一定杀死所有的生物。具有消毒作用的药物称为消毒剂。防腐或称抑菌，阻止或抑制微生物生长繁殖，以防止物品的腐败，但不一定杀死微生物。用以防腐的药物称为防腐剂。有的化学药品在高浓度时可为消毒剂，低浓度时即为防腐剂(乙醇)。无菌是指没有活菌存在的意思。防止细菌进入机体或物体的一系列操作方法称无菌技术（或无菌操作）。3．2．1物理灭菌法热力灭菌是常用而可靠的灭菌方法，包括干热灭菌和湿热灭菌。湿热灭菌可引起菌体蛋白质变性和凝固，以及核酸降解，湿热并可引起细胞的损伤，致使K+等物质漏出。干热灭菌除使蛋白质变性外，由于电解质浓缩也可对细菌产生毒性作用。细菌对热力的抵抗力可由于细菌种类、发育时期及有无芽胞的不同而异。热力灭菌法种类设备及要求效果用途干热灭菌焚烧法燃烧或在火焰上烧灼灭菌废弃的污物、尸体、干烤法干烤箱，160～170℃，1～2h灭菌玻璃器皿等湿热灭菌煮沸法煮沸锅，100℃，5～10min消毒手术器械、注射器间歇灭菌法流动蒸气灭菌器或蒸笼，100℃，15～30min,移入37℃过夜，每日一次连续三日灭菌不耐高温（100℃以上）的物品巴氏消毒法加热61.1-62.8℃,30mim消毒消毒牛奶、酒精高压蒸气灭菌法高压蒸气灭菌器，通常蒸气压为102.97Kpa，（1.05Kg/cm2），温度121.3℃,15-30min灭菌耐高温物品、如普通培养基、生理盐水、敷料，手术衣帽、手术器械、注射器等高压蒸气灭菌法是灭菌效果最彻底的方法。高压蒸气灭菌器是一密封的蒸锅，蒸气不能外溢，随着蒸气压力增加，水的沸点上升器械内温度升高，器内温度升高，杀菌力也大为增强，通常在102.97kPa(1.05Kg/cm2)的压力下，温度可达成121.3℃，维持15~30min，可杀死一切微生物，包括细菌的芽胞。凡耐高温和不怕潮湿的物品均可用此法灭菌。低温细菌对寒冷有较强的耐受性，只有少数病原菌如脑膜炎球菌、流感杆菌耐受性较低。在低温条件下，细菌的代谢缓慢，但仍能保持生命，一旦温度等条件适宜，又可恢复繁殖。因此一般细菌菌种常保存于冰箱（0~4℃）中。此外，应用冷冻真空干燥法更适于长期保存菌种和病毒。紫外线紫外线的波长在240~280nm时杀菌力最强，尤其在波长260nm，部分细菌的DNA吸收最多。紫外线主要是使DNA的同一股上相邻的嘧啶之间形成共价键，产生嘧啶双聚体，干扰正常碱基的配对导致细菌变异或死亡。但紫外线穿透力较弱，只适用于空气和物体表面的消毒。人工紫外灯常用于手术室、传染病房、烧伤病房和无菌室的空气消毒。3．2．2化学因素对细菌的影响许多化学药物能抑制细菌的生长繁殖或杀死细菌，广泛用作消毒剂、防腐剂或化学疗剂。（1）消毒防腐剂的作用原理：消毒防腐剂的种类很多，其杀菌或抑菌机理因其种类而不同：①使菌体蛋白质变性或凝固，如重金属离子容易和带阴电荷的细菌（主要是菌体蛋白质）相吸附，使之变性或沉淀，酒精、石炭酸、甲醛、酸、碱等或使蛋白质脱水变性或与蛋白质结合，使之变性凝固。②干扰细菌的酶系统，如高锰酸钾、过氧化氢等氧化剂，以及重金属离子能与细菌酶蛋白的-SH基结合，使之失去酶活性，导致细菌代谢功能发生障碍而死亡。③改变细胞膜的通透性，如表面活性剂能提高膜的渗透作用，一些重要的代谢物质自细胞渗出，引起死亡。如酚类即能破坏细胞膜，使胞内组分漏出。（2）常用消毒防腐剂的种类、浓度和用途类别名称常用浓度用途备注重金属盐类红汞.20%水溶液皮肤粘膜小创伤消毒硫柳汞0.01%0.1%①生物制品防腐②皮肤、手术部位消毒硝酸苯汞先配成1/1500高压灭菌，稀释成0.002%生物制品防腐硝酸银1%新生儿滴眼，预防淋球菌感染有腐蚀性氧化剂高锰酸钾0.1%皮肤、尿道消毒，水果、蔬菜消毒过氧化氢3%口腔粘膜消毒，冲洗伤口（厌氧菌感染）过氧乙酸0.2~0.5%塑料、玻璃、人造纤维水泄消毒及洗手20%浓度的市售品无爆炸危险，原液对皮肤、金属有强烈腐蚀性卤素及其化合物漂白粉10~20%每升水加5~10mg①排泄物、地面、厕所消毒②饮水消毒不能用于衣物、有色金属的消毒氯胺0.2~0.5%水溶液0.1~0.2%①室内空气及表面消毒（喷雾）②浸泡衣服碘酒2~2.5%皮肤消毒不能与红汞同用。刺激性大涂后用酒精擦拭醇类酒精70~75%皮肤、体温计消毒消毒力不强，对芽胞无效醛类甲醛10%浸泡物体表面消毒蒸气消毒：10%溶液加等量水，蒸发，密闭房间6～24h；或加半量高锰酸钾，产生黄色浓烟，消毒房间酚类石炭酸来苏儿3~5%地面、家具、器皿表面消毒，2%皮肤消毒杀菌力强，有特殊气味表面活性剂（季胺盐类）新洁尔灭0.05~0.1%外科手术洗手，皮肤粘膜消毒，浸泡手术器械对芽胞无效；遇肥皂及其他洗涤剂作用减弱杜灭芬（消毒宁）0.05~0.1%皮肤创伤冲洗，金属器械、棉织品、塑料等消毒遇肥皂或洗涤剂效果减弱乙烷洗必泰0.02~0.05%0.01~0.025①术前洗手（浸泡5min）②腹腔、膀胱及阴道冲