微生物的大小测定与显微计数

微生物实验PAGEPAGE1实验二微生物的大小测定与显微计数一、实验目的学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法。了解血细胞计数板的构造及计数原理。掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。二实验原理酵母菌大小测定在显微镜下，测微尺可完成对微生物大小的测定。测微尺包括目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块放入目镜中的圆形玻片，在玻片中央把10mm的长度刻成100等分，用于测量经显微镜放大后的细胞图像。测量前，需先用镜台测微尺校正。镜台测微尺是专门用来校正目镜测微尺的。微生物数量的测定图一血细胞计数板构造血细胞计数板（图一）是一块特制的载玻片，薄片上有4条槽构成3个平台，中间较宽的平台又被一短槽隔成两半，每一边平台各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。图一血细胞计数板构造图二血细胞计数室构造（16×25）计数室（图二）的刻度有两种：一种大方格分为16个中方格，每个中方格分成25个小方格；一种大方格分成25个中方格，中方格分成16个小方格。每个大方格都是400个小方格，边长为1mm，面积1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。图二血细胞计数室构造（16×25）三实验仪器、材料和用具实验用具：载玻片、盖片、200µl移液器及tip、擦镜纸、装有蒸馏水的洗瓶。实验仪器：普通生物显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、手动计数器;菌种：酿酒酵母（200rpm，28℃，24h，稀释20倍四实验步骤酵母菌大小测定（1）目镜测微尺的校正在100倍镜下，使目镜测微尺的目镜和镜台测微尺某一个区域内两线完全重合。计数两重合刻度之间目镜测微尺和镜台测微尺的格数（格数必须是整数）。（2）细胞大小的测定将稀释40倍的少量的酵母培养液涂在载玻片上，用盖玻片推开，放在载物台上。用100倍镜观察，用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格。测定20个菌体，统计计算。（3）测定完毕后，将目镜测微尺和物镜测微尺擦拭干净包好归还。微生物数量的测定菌液准备：将啤酒酵母在28℃，100r/min培养8h。4镜检计数室：加样前，对计数板的计数室镜检，若有污物需要清洗，干燥后使用。加样品：将血细胞计数器中间平台盖上盖玻片，用无菌水吸管将摇匀的啤酒酵母菌悬液由盖玻片的边缘滴一小滴，让菌液靠毛细渗透作用自动进入到计数室。显微镜计数：加样后将血细胞计数板置于显微镜的载物台上，静置1min后，用4倍镜找到计数室，再换10倍镜进行计数。对两个计数室各计数一次。酵母菌计数完毕后，马上将其用洗瓶冲洗，自然晾干，或者用擦镜纸轻轻擦干。重新加样：按照前面的步骤再计数5次。利用公式计算出血细胞的数量。五、实验结果1.酵母菌大小测定已知镜台测微尺每格10μm，所以根据下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的实际长度：物镜倍数（目镜10×）目镜测微尺格数（小格）镜台测微尺格数（小格）目镜测微尺每格长度(μm)100×111．011.00.99表一目镜测微尺标定结果.菌号12345678910目镜测微尺格数（长轴）9.18.58.08.98.16.39.27.27.08.5目镜测微尺格数（短轴）6.06.06.98.06.05.37.26.86.86.1菌号11121314151617181920目镜测微尺格数（长轴）6.97.17.18.08.09.07.010.09.07.0目镜测微尺格数（短轴）5.06.55.27.86.285.18.97.05.2表二酵母菌大小的测定结果(100×)经计算得：酵母菌长轴平均值7.995×0.99μm＝7.92μm；酵母菌短轴平均值6.500×0.99μm＝6.44μm酵母菌体积平均值=4πabc/3=172.04μm3随机误差使测量值具有一定的分散性，实验标准偏差可用s表征，s可以用贝塞尔公式算出：其中n在这次实验中为20计算得μmμm不确定度置信度为0.95时，查表，t=2.093，则=0.468所以μm；μm综上，酵母菌长轴7.92±0.47μm酵母菌短轴6.44±0.52μm酵母菌悬液显微计数实验次数各中格中菌数总细菌数稀释倍数平均值菌数个/ml左上右上右下左下中119121316157540661.3×108212131710106231210141213614171021191986514115912516891616166577157484185755931919141414288910121517101872116181815137012141723181789表三用血细胞计数板对酵母菌悬液计数结果酵母菌体积含量=酵母菌细胞数/ml单个细胞体积=/ml172.04μm3=2.3%六实验总结和分析数据分析：（1）查资料得，酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10μm，实验结果符合。（2）从显微计数测量结果（表三）分析：通过计算，发现其他组的标准偏差都在1到5个之间，但第9组标准偏差达到了6.1个，说明菌液分布不均匀，中间一格数目很多，也许是因为没有摇匀，或者通过毛细现象吸入装片下时不够均匀。比较可得，第7、8组数据都偏小，这两组数据是一起测量的，而且测量前可能是摇匀了菌液的，所以怀疑是上一次洗了计数板后没有晾干，在两个计数室区域之间的小沟里有水残留，后来加入菌液时被稀释。关于结果：我的结果和旁边组的人差异很大，除了拿到的菌液可能有差异外，我觉得个人主观因素应该也有一定影响。比如测量长度时候选择细胞，虽然说要选取各种大小的细胞测量，但个人可能选择到的细胞大小不同，而且读数时也会因人而异；计数时也是，对于出芽酵母，老师给的标准是大于母细胞一半就算一个细胞，但是每个人的判断是不一样的，有的和母细胞大小一半差不多的细胞，有人会计数，有人就不会计。关于操作：测量大小时，要把目的细胞中心放在视野正中，这样调节目镜测微尺测量长短轴会很方便，并使细胞的一边与一条刻度尺相切，以减少读数误差。调节观察显微计数时，要把聚光器调低，光线调暗，这样比较容易在一个焦平面上看到计数室和酵母细胞。计数过程中，可以调节细准焦螺旋，防止遗漏不同空间位置的细胞。吸取溶液前摇匀，可以用吸管吹吸几次再取。滴加菌液时不要太多，恰好渗入即可。七思考题1．根据你的实验体会，说明计数板的误差主要来自哪些方面？计数板上残留着上一次计数的酵母清洗计数板后没有晾干就再次使用酵母菌液在稀释、分装过程中可能产生误差溶液不均匀造成的误差过多溶液渗入计数器，并且细胞沉积统计组数有限造成的随机误差计数的误差，如忽略体积较小的酵母菌、计算了很小的出芽、边缘细胞计数重复或漏记滴加太多使得盖玻片飘起来，体积不准确，错误判断酵母芽体大小2．显微测微尺上的刻度大小和放大倍数会影响到测量结果吗?刻度大小会影响，因为刻度大小和测量精度直接相关。如果一个酵母连一格都占不到，测量结果肯定不会准确。放大倍数也有影响，虽然理论上说，测定的结果应该是基本上相同的，因为真实值是不变的。但由于人眼的精度限制，在低倍物镜下观察到的菌体可能比较小，甚至都不到目镜测微尺一小格，这时测量的偏差会比较大。所以在实验中选用放大倍数比较大的物镜，在能清晰地观测菌体的情况下进行测量。3．假设酵母菌是标准的椭球体，根据实验结果，试推算酵母菌培养液中酵母菌的体积含量。酵母菌长轴平均值7.995×0.99μm＝7.92μm酵母菌短轴平均值6