DB21-T 2980-2018黑果腺肋花楸组培育苗技术规程

ICS65.020.40

B60

备案号：60598-2019DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2980—2018

黑果腺肋花楸组培育苗技术规程

TechnicalregulationontissuecultureofAroniamelanocarpa

DB21/T2980—2018

前言

本标准依据GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由辽宁省林业厅提出并归口。

本标准起草单位：辽宁省林业科学研究院。

本标准的附录A、B为资料性附录

本标准主要起草人：马冬菁、陈罡、刘怡菲、孟凡金、高英旭、张素清、董莉莉、柴晓东、

丁晓霞、彭庆涛、李强、王丽华、王宠、徐清波、翟金凤、葛芳、赵丽辉、申桂艳、常玉峰、王

妮妮。

II

DB21/T2980—2018

黑果腺肋花楸组培育苗技术规程

1范围

本规程规定了黑果腺肋花楸（Aroniamelanocarpa）组培育苗技术规程，具体包括外植体的采

集与储存、外植体的处理、培养基制作、接种、初代培养、增殖培养、生根培养、试管苗炼苗、

试管苗驯化、试管苗移栽和定植的技术要求。

本标准适用于辽宁省黑果腺肋花楸的组培苗繁育。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用

于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB1882林木组织培养技术规程

《医疗用毒性药品管理办法》

3术语和定义

GB1882规定的以及下列术语适应于本标准。

3.1

植物组织培养

指利用植物体的器官、组织、细胞或原生质体为外植体，依据细胞全能性理论，将外植体接

种于培养基上，在适当的培养条件下，使之发育成完整植株的技术。

3.2

母液

为准确和方便配制培养基，将培养基的成分按一定比例和浓度混和在一起的溶液。

3.3

培养基

将无机盐类、有机物质、植物生长调节剂等化学试剂按一定比例混合，溶解于凝固剂中，装

入培养容器经灭菌而制成的培养物质。

3.4

外植体

用于组织培养的器官、组织、细胞或原生质体。

3.5

初代培养

将灭过菌的外植体接种于琼脂培养基上，诱导出愈伤组织或芽的培养过程。

3.6

增殖培养

1

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将培养材料周期性地分株、分割后转接入新鲜培养基中继续培养的过程。

3.7

增殖系数

一个培养周期内试管芽增殖倍数，即单芽培养一个周期后的平均增殖芽数。

3.8

壮苗培养

将增殖的丛生芽苗切分成单芽，转接入新鲜培养基中，使之生长茁壮的培养过程。

3.9

生根培养

诱导无根试管苗产生根的过程。

3.10

试管苗

培养在容器中无污染的，根、茎、叶具全的完整植株。

3.11

接种

在无菌条件下，用接种工具将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小

块，放入培养基的过程。

3.12

污染率

（污染的外植体数÷接种的外植体数）×100%。

3.13

诱导率

（诱导出芽的外植体数÷接种的无污染的外植体数）×100%。

4外植体的采集与储存

4.1外植体的采集

每年的5月～6月，选择连续3天以上的晴天，剪取无病虫害的带有顶芽或幼嫩茎段的枝条，

标明采集时间、地点。

4.2外植体的储存

外植体宜当天采集，当天处理，贮存于低温保鲜盒或冰箱，若需长途运输，应采取空运。

5外植体的处理

5.1无菌水的制备

量取500ml～800ml蒸馏水，装入1L大三角瓶，封口膜扎紧后，放入高压锅内灭菌20min～

25min，保持锅内气压在0.1MPa～0.11MPa（120℃～122℃）。

5.20.1%升汞制备

2

DB21/T2980—2018

称取1g升汞，加蒸馏水溶解，定溶至1L，装入棕色瓶中，用封口膜扎紧瓶盖，贴上标签，标

明配制浓度、日期。

使用的升汞消毒液应按照国家有关剧毒化学药品使用的法规进行处理。

5.3外植体的消毒

将取回的外植体枝条剪去叶片，将其切成3cm～5cm茎段，流水冲洗2h～3h，用15倍稀释的新

洁尔灭溶液浸泡2min～3min，再用清水冲洗30min左右；然后置于超净工作台上用70%的酒精加两

滴吐温20消毒40s，用无菌水冲洗3次后，再用浓0.1%HgCl2浸泡5min～7min,无菌水冲洗5次，放置

培养皿中，切成1.0cm～2.0cm的单芽备用。

6培养基的制作

6.1母液的配置与保存

6.1.1制作培养基前需先配制母液，MS培养基母液配制比例参见附表A。

6.1.2母液配制应用蒸馏水。

6.1.3配制大量元素母液时，每个组分应单独溶解，然后按氮、磷、钙、镁的顺序逐一混合。

6.1.4母液应置于冰箱内保存，温度控制在0℃～4℃。微量元素母液应用棕色瓶保存。母液配

制后应及时使用，贮存时间不超过3个月。

6.1.5母液容器上应贴好标签，注明名称、配制日期，发现标签不明或母液中有沉淀、浑浊或

变色现象应停止使用。

6.21L1mol·L-1氢氧化钠（NaOH）和盐酸（HCl）的配制

6.2.1称取NaOH40g，用蒸馏水溶解，定容至1L。

6.2.2量取38%（质量比），密度为1.19的HCl80.7ml，用蒸馏水定容至1L。

6.3植物生长调节物质母液的配制

6.3.1植物生长调节物质母液的配制浓度为0.1mg·L-1～1.0mg·L-1，其配制方法参见附表B。

6.3.2母液配制好后贴好标签并置于冰箱内保存，温度控制在0℃～4℃。

6.41LMS培养基配制

6.4.1按附表A中MS培养基各母液吸取量，依次加入混合。

6.4.2量取琼脂粉5g，加热溶解后，加入母液中。

6.4.3量取蔗糖30g，加热溶解后，加入母液中。

6.4.4量取适量的植物生长调节物质，加入母液中。

6.4.5搅拌均匀后，加蒸馏水定容至1L。

6.4.6充分搅拌后，用pH计或pH试纸测酸碱度，用1mol·L-1NaOH或HCl调节pH值至5.8。

6.5培养基分装

6.5.1准备好培养器皿（200ml的培养瓶）25个，每瓶分装培养基40ml。

6.5.2分装培养基时要快，以免培养基凝回。

6.5.3分装时勿将培养基沾在培养瓶瓶口，以免培养基污染。

6.5.4封口膜采用聚丙烯塑料膜，厚度0.06mm（6丝），线绳扎紧。

6.6培养基的灭菌

6.6.1将分装好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅内，关好锅盖。

6.6.2加热初期，当高压灭菌锅内的气压达0.05MPa时，打开冷凝阀，排尽灭菌锅内冷空气。

6.6.3当灭菌锅内气压达到0.11MPa，温度达121℃时开始计时，保持温度并进行压力灭菌20

min～25min。

3

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6.6.4关闭加热电源开关，以慢排方式排放热气。待灭菌锅内的气压降至大气压时再取出培养

基。

6.7培养基的保存

6.7.1培养基应置于接种室内进行冷却。灭菌后的培养基应注明培养基编号及配制日期。

6.7.2为保证培养基质量，储存时间不超过2周。

7接种

7.1量取70ml的无水乙醇加30ml的蒸馏水，配制成70%的酒精。

7.2接种器械、器皿及定性滤纸用棉布或纸包好，高压灭菌锅灭菌后备用，灭菌方法同6.6。

7.3久未使用的超净工作台，用75%酒精将其台面、两侧挡板、紫外灯和接种工具等擦拭干净。

7.4接种前利用紫外线杀菌25min～30min，杀菌后通风20min后，再进行接种操作。

7.5接种时，超净工作台上的风机要始终保持开启状态，确保通风顺畅。

7.6每转接完一批苗，器械在酒精灯外焰上灼烧到10S以上，消毒后应适当冷却，避免烫伤培

养材料，同时更换器皿中的纸张，避免交叉感染。

7.7每个培养容器中接种小芽丛或单芽的数量为3个～4个，且分布均匀。

7.8接种完成后，在培养容器上标注接种日期、编号或名称。

7.9每次接种完毕后，用75%酒精将工作台的台面及两边挡板等擦拭干净，同时将接种器皿及接

种工具重新进行消毒处理。

8初代培养

8.1初代培养基

MS+6－BA0.2mg·L-1～1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1～0.5mg·L-1+琼脂粉5g·L-1+蔗糖30g·L-1。

8.2培养条件

温度23℃±2℃，光照强度2000lux～3000lux，光照周期12h·d-1。

8.3污染率要求

初代培养污染率≤50%。

8.4诱导率要求

初代培养诱导率≥50%。

9增值培养

9.1增值培养基

MS+6－BA0.2mg·L-1～1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1～0.2mg·L-1+琼脂粉5g·L-1+蔗糖30g·L-1。

9.2接种方法

初代培养萌发的试管苗，选取未污染的，切取其顶芽或茎段，转接于增殖培养基中。

9.3接种株数

每瓶均匀接种4株～5株。

9.4培养条件

同8.2。

9.5增殖培养周期

4

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30d～40d。

9.6增殖系数要求

增殖系数≥8。

9.7污染率要求

污染率≤5%。

10壮苗培养

10.1壮苗培养基

MS0+琼脂粉5g·L-1+蔗糖30g·L-1。

10.2壮苗培养条件

同8.2。

10.3壮苗培养周期

培养周期20d～30d。

10.4壮苗培养要求

株高≥3cm，茎粗≥0.8mm，单株复叶≥4片。

11生根培养

11.1生根培养基

1/2MS+ABT6.0mg·L-1+琼脂粉5g·L-1+蔗糖30g·L-1。

11.2接种方法

切取壮苗后的试管芽，将单个壮芽接种于生根培养基中。

11.3接种株数

每瓶均匀接种3株～5株。

11.4培养条件

同8.2。

11.5污染率要求

生根培养污染率≤5%。

11.6生根率要求

生根率≥95%。

11.7生根周期

生根周期2～3周。

11.8试管苗质量要求

叶片绿色，株高≥2.5cm，根茎粗≥0.2cm，节间2～3个，单株复叶≥4片，根白柔软，根数

≥6条，平均根长1.5cm～2.0cm。

12炼苗

5

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12.1炼苗季节

春季3月～4月。

12.2环境要求

炼苗于日光温室内进行，将试管苗放置温室自然散射光下，温度控制在18～28℃，湿度≥65%，

光照强度1000lux～2000lux。

12.3炼苗时长

试管苗在温室内炼苗3d～4d。

13驯化

13.1去培养基

试管苗炼苗结束后，将试管苗连同培养基用镊子一同取出，放入35℃的温水中，洗净附于苗

上的培养基。

13.2驯化基质

细河沙：珍珠岩＝2:1，搅拌均匀，并用0.5%的高锰酸钾冲洗驯化基质。

13.3驯化方法

将消过毒的基质装入穴盘中压实，用镊子将每个穴盘扎出小孔，将组培苗放入孔内，浇透水，

放进塑料拱棚内。

13.4管理要求

控制塑料拱棚内温度20℃～30℃，自驯化开始，前2周每2d～3d浇透一次水，每天适当保持

通风，以后逐渐增加通风时间，减少浇水次数，第4周去除塑料膜，每天浇透一次水。

13.5驯化时长

3～4周。

6

DB21/T2980—2018

附录A

（资料性附录）

MS培养基母液的配制表

表A.1MS培养基母液的配制表

母液定配制培养基

母液浓度扩大100倍

化学试剂名称分子式或英文名级别容体积吸取量

名称mg·L-1称取量

mlml·L-1

硝酸铵NH4NO3AR1650165g400040

大销酸钾KNO3AR1900190g--

量

磷酸二氢钾KHPOAR17017g--

元24

素

硫酸镁MgSO4.7H2OAR37037g--

二水氯化钙CaCl2.2H2OAR44044g--

碘化钾KIAR0.8383mg100010

硼酸H3B03AR6.2620mg--

微硫酸锰MnSO4.H2OAR22.32230mg--

量

硫酸锌ZnSO.7HOAR8.6860mg--

元42

素

钼酸钠NaMO4.2H2OAR0.2525mg-

硫酸铜CuSO4.5H2OAR0.0252.5mg--

氯化钴CoCl.6H2OAR0.0252.5mg--

乙二胺四乙酸二钠

铁Na2-EDTAAR37.33730mg100010

盐

硫酸亚铁FeSO4.7H2OAR27.82780mg--

甘氨酸GlycineBR99.5%2.0200mg100010

有

盐酸硫胺素(维生素B1)Thiamine.HClBR99%0.110mg--

机

物盐酸吡哆醇（维生素B6）Pyridoxine.HClBR99%0.550mg--

烟酸Nicotinicacid(vitB5)BR99.5%0.550mg--

肌醇肌醇Myo-inositolBR10010g100010

7

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BA

附录B

（资料性附录）

常用植物生长调节物质配制表

表B.1常用植物生长调节物质配制表

配制浓度

化学试剂名称分子式或英文名级别配制方法定容容器

mg·L-1

先用1mol·L-1的盐酸200ml

6-苄氨基嘌呤（6－

6-BenzylaminopurineBR（HCl）溶解，再加少量蒸500

BA）褐色广口

馏水定容。瓶

200ml

1-Nnphthylacetic先用1mol·L-1的NaOH溶

萘乙酸（NAA）BR500

acid解，再加少量蒸馏水定容。褐色广口

瓶

200ml

Indole-3-butyric先用1mol·L-1的NaOH溶

吲哚丁酸（IBA）BR500

acid解，再加少量蒸馏水定容。褐色广口

瓶

_________________________________

8

DB21/T2980—2018

目次

前言............................................................................II

1范围...........................................................................1

2规范性引用文件.................................................................1

3术语和定义.....................................................................1

4外植体的采集与储存..............................................................2

5外植体的处理...................................................................2

6培养基的制作...................................................................3

7接种...........................................................................4

8初代培养.......................................................................4

9增值培养.......................................................................4

10壮苗培养......................................................................5

11生根培养......................................................................5

12炼苗..........................................................................5

13驯化..........................................................................6

附录A（资料性附录）MS培养基母液的配制表....................................7

附录B（资料性附录）常用植物生长调节物质配制表...............................8

I