DB21-T 2870-2017大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶基因型PCR检测方法

ICS11.220

B41

备案号：58553-2018DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2870—2017

大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶基因型

PCR检测方法

DB21/T2870—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。

本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁省动物医学研究院。

本标准主要起草人：赵凤菊，赵晓彤，李清竹，关淼，刘坤洋，关乃鹏，陈瑶，邓文超，吴运谱，

马建山，赵培。

II

DB21/T2870—2017

大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶基因型PCR检测方法

1范围

本标准规定了大肠杆菌ESBLs基因型的PCR检测。

本标准适用于在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行大肠杆菌ESBLs基因型的检测，适用于

产ESBLs大肠杆菌ESBLsTEM、CTX-M、SHV和OXA4种基因型的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

中华人民共和国农业部公告第302号（《兽医实验室生物安全技术管理规范》）

3缩略语

下列缩略语适用于本标准。

E.coli：大肠杆菌（Escherichiacoli）

ESBLs：超广谱β-内酰胺酶（extendedspectrumbeta-lactamase）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

DNase：脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease）

bp：碱基对（basepair）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

TE缓冲液：TE缓冲液（Tris-EDTAbuffersolution）

TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Trisacetate-EDTAbuffer）

4原理

根据E.coliESBLs的TEM、CTX-M、SHV和OXA基因序列设计四对特异性引物，在DNA聚合酶催化下，

以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链

DNA。

5仪器和器材

1

DB21/T2870—2017

5.1高速台式冷冻离心机（离心范围0～20000r/min）

5.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-70℃±1℃冰箱。

5.3PCR扩增仪

5.4电泳仪

5.5凝胶成像系统

5.6微波炉

5.7分析天平

5.8离心管：15mL离心管、1.5mL离心管和0.2mLPCR专用离心管。

5.9微量可调移液器：1000μL，200μL，100μL，50μL，20μL，10μL，2μL。

6试剂和引物

注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含DNA或DNase的分

析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。

6.1DNA抽提试剂：DNAzol®Reagent，外观为淡绿色，于4～8℃保存。

6.2无水乙醇：-20℃预冷。

6.375%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。

6.4Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（5U/μL）。

6.5dNTP（2.5mmol/L）。

6.6阴性对照：灭菌双蒸水。

6.7阳性对照：大肠杆菌ESBLs阳性菌株。

6.8无菌生理盐水。

6.9TE缓冲液（pH8.0）。

6.10TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液。

6.11溴化乙锭。

6.12DL2000DNAMarker。

6.13引物

用于PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列及扩增产物大小见表1。

表1ESBLs四种基因型的PCR引物

基因型引物序列扩增产物大小/bp退火温度/℃

F5’-CGATACGGGAGGGCTTAC-3’

TEM503

R5’-CGGTCGCCGCATACACTA-3’

55

F5’-AATTAGAGCGGCAGTCGG-3’

CTX-M697

R5’-GGTTGAGGCTGGGTGAAG-3’

F5’-TTATCTCCCTGTTAGCCACCCT-3’

SHV83856

R5’-TAGCGTTGCCAGTGCTCGAT-3’

F5’-CGCCAGTGCATCAACAGATA-3’

OXA70454

R5’-AATTCGACCCCAAGTTTCCT-3’

2

DB21/T2870—2017

7操作步骤

7.1样品制备

将大肠杆菌划线接种于麦康凯培养基于37℃培养18～24h后，挑选典型菌落，用1mL无菌生理

盐水制备成一定浓度的菌悬液。

7.2DNA提取

7.2.1DNA的提取按照DNAzol®Reagent提取试剂说明书进行，并设立阳性对照、阴性对照。

7.2.2将800μLDNAzol加入1.5mL灭菌离心管中，然后分别加入被检样品、阳性对照和阴性对

照各200μL，颠倒混匀后，4℃12000r/min离心10min。

7.2.3然后吸取900μL上清液转移至新的1.5mL灭菌离心管中，再加入500μL无水乙醇混匀，

4℃12000r/min离心5min。

7.2.4弃上清，加入1mL75%乙醇，4℃12000r/min离心5min。重复洗2次。

7.2.54000r/min离心10s，用微量可调移液器小心将残余液体吸干，室温干燥3～10min。

7.2.6加入20μLTE缓冲液或经高压处理的灭菌双蒸水，轻柔混匀，溶解管壁上的DNA，冰上保存

备用；若需长期保存应放置-70℃冰箱。

可以采用其他等效DNA提取方法或合法化商品化DNA提取试剂盒进行操作。

7.3PCR检测

7.3.1PCR反应体系

建立25μL反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中：

——灭菌蒸馏水17.375μL

——10×PCRBuffer2.5μL

——2.5mmol/LdNTP2μL

——ExTaqDNA聚合酶0.125μL

——上游特异性PCR引物0.5μL

——下游特异性PCR引物0.5μL

——DNA模板2μL

7.3.2PCR反应条件

94℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度根据引物进行选择（54℃、55℃或

56℃）退火45s，72℃延伸30s，循环35次后72℃延伸10min，4℃保存反应产物。

7.3.3电泳

将PCR扩增产物6μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL

溴化乙锭）板点样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000DNAMarker（分子质量标准

物），缓冲液为1×TAE，以5V/cm电压电泳25min。

8试验成立条件与结果判定

8.1试验成立条件

3

DB21/T2870—2017

8.1.1阴性对照

阴性对照未出现特异性扩增条带。

8.1.2阳性对照

8.1.2.1TEM基因型阳性对照出现503bp的扩增条带；

8.1.2.2CTX-M基因型阳性对照出现697bp的扩增条带；

8.1.2.3SHV基因型阳性对照出现838bp的扩增条带；

8.1.2.4OXA基因型阳性对照出现704bp的扩增条带。

当在同一次实验中同时符合以上条件时实验成立，否则实验无效，需重新进行。

8.2结果判定

在紫外凝胶成像仪下观察结果，实验成立时，如果被检产ESBLs大肠杆菌出现预期大小的扩增

条带时，则可初步判断被检菌株携带相应的基因型ESBLs，初步判断为阳性结果的菌株可通过核酸

序列测定进行确认。如果被检产ESBLs大肠杆菌未出现预期大小的扩增条带，则可判断被检菌株未

携带相应的基因型ESBLs。

9检测过程中防止交叉污染的措施

按照GB/T19495.2-2004的规定执行。

10废弃物处理

按照GB19489-2008的规定执行。

4

DB21/T2870—2017

AA

附录A

（规范性附录）

试剂配制

A.1电泳缓冲液（50倍）

A.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）

二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯）18.61g

灭菌双蒸水80mL

氢氧化钠调pH至8.0

灭菌双蒸水加至100mL

A.1.2TAE（三羟甲基氨基甲烷一乙酸）电泳缓冲液（50倍）

羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）242g

冰乙酸57.1mL

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100mL

灭菌双蒸水加至1000mL

用时用灭菌双蒸水稀释使用。

A.2TE缓冲液（pH8.0）

A.2.11mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液

取12.11gTris置于100mL烧杯中，加入80mL去离子水，充分搅拌溶解，冷却至室

温后，用浓盐酸调pH值至8.0，定容至100mL，121℃高压15min，室温保存。

A.2.210倍TEBuffer

取10mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液和0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液2mL置于

100mL烧杯中，加入80mL去离子水，均匀混合，定容至100mL后，121℃高压15min，室温

保存。使用时进行10倍稀释。

A.3溴化乙锭（EB）溶液（10μg/μL）

溴化乙锭200mg

灭菌双蒸水20mL

A.4含0.5μg/mL溴化乙锭的1%琼脂凝胶

琼脂糖（电泳级）1g

TAE电泳缓冲液（50倍）2mL

灭菌双蒸水98mL

5

DB21/T2870—2017

微波炉中完全融化，待冷至50～55℃时，加溴化乙锭（EB）溶液5μL。

_________________________________

6

DB21/T2870—2017

目次

前言..............................................................................II

1范围................................................................................1

2规范性引用文件......................................................................1

3缩略语..............................................................................1

4原理................................................................................1

5仪器和器材..........................................................................1

6试剂和引物..........................................................................2

7操作步骤............................................................................3

8试验成立条件与结果判定..............................................................3

9检测过程中防止交叉污染的措施........................................................4

10废弃物处理.........................................................................4

附录A（规范性附录）试剂配制........................................................5

I

DB21/T2870—2017