第14章DNA的生物合成

第十四章DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)前言1958年FrancisCrick提出遗传信息传递的中心法则1970年DBaltimore对遗传信息传递的中心法则作出补充复制(replication)是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。复制亲代DNA子代DNA本章主要内容：DNA复制的基本特征

DNA复制的酶学和拓扑学变化原核生物DNA复制过程真核生物DNA生物合成过程逆转录和其他复制方式DNA复制的基本特征BasicRulesofDNAReplication第一节半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)DNA复制的主要特征一、半保留复制的实验依据和意义DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念子链继承母链遗传信息的几种可能方式:

全保留式半保留式混合式AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA

复制过程中形成的复制叉子代DNA

目录1958–MatthewMeselson和FranklinStahl美国科学家马修.梅塞尔(MatthewKeelson)福兰克林.斯塔尔(FranklinStahl)密度梯度实验

——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代梯度离心结果按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制。二、DNA复制从起点向两个方向延伸复制中的放射自显影图象A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)

。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制3’三、复制的半不连续性3

5

3

5

解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。

领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

DNA复制的酶学和拓扑学变化TheEnzymologyofDNAReplication第二节参与DNA复制的物质底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):

解开成单链的DNA母链引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白质因子一、复制的化学反应

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

目录聚合反应的特点DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3

方向进行。二、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´3

5

外切酶活性5

3

外切酶活性?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。

核酸外切酶活性目录（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ（一）原核生物的DNA聚合酶功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。(损伤修复，填补空隙）DNA-polⅠ（109kD）323个氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

3

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)２个核心酶1个

-复合物（

、

、

、

、

、

6种亚基）1对

-亚基（可滑动的DNA夹子）DNA聚合酶Ⅲ全酶结构全酶结构包括：

亚基（132000）主要功能是5

方向合成DNA

亚基具有3

5

外切酶活性（复制保真性所必需）

亚基可增强其活性

亚基可能起组装作用核心酶由

、

和

亚基组成：两侧的β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用2个

-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用

-复合物由6种亚基组成：

、

、

、

、

、

α亚基具有5′→3′方向合成DNA的催化活性ε亚基具有3′→5′外切酶活性，起校对功能，可提高聚合酶Ⅲ复制DNA的保真性亚基可能起组建的作用β亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住DNA

分子向前滑动

亚基起着促使核心酶二聚化的作用其余的亚基构成-复合物，主要功能是帮助亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有增强核心酶活性的作用亚基相对分子质量亚基数目亚基功能α1320002聚合活性ε2700025

外切酶校对活性θ100002组建核心酶τ710002核心酶二聚化γ520002依赖DNA的ATP酶，形成γ复合体δ350001可与β亚基结合，形成γ复合体δ,330001形成γ复合体χ150001形成γ复合体φ120001形成γ复合体β370004两个β亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力夹子装置器DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ不同种类亚基数目1≥7≥10相对分子质量103000880009000005´→3´核酸聚合酶活性+++3´→5´核酸外切酶活性+++5´→3´核酸外切酶活性+--聚合速度（核苷酸/分）1000~1200240015000~60000持续合成能力3~2001500≥500000分子数/细胞40010010~20功能切除引物，修复修复复制（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制,参与核DNA的修复.在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较E.Coli真核细胞

功能Ⅰ填补复制中的DNA空隙，DNA修复和重组Ⅱ复制中的校对，DNA修复

DNA修复

线粒体DNA合成Ⅲ

错配修复DnaG

引物酶

前导链和平后随链合成三、复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读

（二）复制的保真性和碱基选择（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。（二）复制的保真性和碱基选择•DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。•利用“错配”实验发现，DNApolⅢ对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能。

嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型

DNApolⅢ对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，

因此实现其选择功能。

1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制

三、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白E.Coli基因图目录解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

解旋酶(helicase)解螺旋酶作用：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链dnaA、B、C…DnaA、B、C…ATP引物酶(Primase)

5´5´催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶DNA合成需在RNA引物的基础上进行RNA引物5´3´5´3´单链DNA结合蛋白（SSB）作用：防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解（协同效应）SSB108

局部解链后（二）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

解链过程中正超螺旋的形成目录拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ分类拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制

五、DNA连接酶连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’目录DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能提供核糖3

-OH提供5

-P结果DNA聚合酶引物或延长中的新链游离dNTP去PPi(dNTP)n+1连接酶复制中不连续的两条单链不连续→连续链拓扑酶切断、整理后的两链改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3

,5

-磷酸二酯键生成的比较

小结主要成员

主要作用DnaA识别复制起始位点解螺旋酶解开DNA双链SSB维持已解开单链DNA的稳定引物酶合成RNA引物TOPO使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰DNA-polⅢDNA复制DNA-polⅠ水解引物、填补空隙、修复作用DNA连接酶催化双链DNA中单链缺口的连接原核生物DNA复制过程TheProcessofDNAReplicationinProkaryotes第三节1.复制的起始2.复制的延长3.复制的终止起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物。

需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。一、复制的起始E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列5

3

5

3

1.DNA解链E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，有3组串联重复序列和2对反向重复序列

GATTNTTTATTT…GATCTNTTNTATT…GATCTCTTATTAG串联重复序列

反向重复序列…TTTGGATAA…..TTATCCACA

TGTGGATTA……TTATACACA…

2.引发体和引物原核生物的复制起始部位及解链

前引发复合体DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶引发体和复制叉的生成

（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目录领头链的合成目录随从链的合成目录复制过程简图

在复制叉同时合成前导链和后随链原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500三、复制的终止终止子位点：terA-terFTus:与终止子位点结合的蛋白质5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA连接酶

子链中的RNA引物被取代

由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来。真核生物DNA生物合成过程TheProcessofDNABiosynthesisineukaryotes第四节1.复制时需要解开和重新组装核小体结构;2.多起点复制3.RNA引物及冈崎片段的长度均小于原核生物4.真核生物染色体全部复制完成以前不会发动新一轮的复制.真核生物与原核生物DNA复制的差异：哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。•真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。•复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。•增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制的起始DNA-polδ和polα分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-polδ通过PCNA的协同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3

-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由polα催化合成。然后由PCNA协同，polδ置换polα，继续合成DNA子链。二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶α/δ转换3

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA随从链引物核小体（二）复制的延长3

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA后随链引物核小体三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

目录端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性结构特点•由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含T、G碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成

对外:抵御核酸酶等外界对内:染色体脱氧核糖核酸的因素的袭击末端复制问题保护染色体结构和功能的完整性染色体染色体脱氧核糖核酸的末端复制问题：3’5’5’3’RNA引物3’3’RNA引物水解

即DNA复制过程不能"自始至终"完整地复制整个线性染色体，而是每次都在其5'末端留下一个空缺未能填补（即RNA引物降解），如果细胞没有办法添补这些空隙，染色体DNA将随着每一次的细胞分裂而不断缩短，直至这种缺隙侵蚀到染色体的结构基因而使细胞消亡。端粒酶的催化延长作用爬行模型目录DNA聚合酶复制子链进一步加工目录逆转录和其他复制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第五节双链DNA是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是RNA。原核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。反转录酶(reversetranscriptase)反转录(reversetranscription)RNADNA反转录酶一、反转录病毒和反转录酶

反转录病毒细胞内的反转录现象RNA模板反转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA反转录酶双链DNARNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。逆转录酶催化的cDNA合成

二、反转录研究的意义

反转录酶和反转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。

反转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对反转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

滚环复制(rollingcirclereplication)三、滚环复制和D环复制

是某些低等生物的复制形式，如

X174和M13噬菌体等。3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滚环复制5'

5

3

3

5

目录dNTPDNA-polγ

D环复制(D-loopreplication)

是线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的复制形式。

D-环复制时需合成引物。mtDNA为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制。复制中呈字母D形状而得名。D环复制的特点是复制起始点不在双链DNA同一位点，内、外环复制有时序差别。DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)andRepair第六节遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNAdamage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。

一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础

二、引发突变的因素物理因素紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射

UV化学因素目录三、突变的分子改变类型错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

DNA分子上的碱基错配称点突变(pointmutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。

2.颠换（一）错配镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CTCGAG基因（二）缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。移码突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。

缺失或插入都可导致移码突变

。谷酪蛋丝5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬组缬正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突变（三）重排DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。

由基因重排引起的两种地中海贫血基因型目录四、DNA损伤的修复修复(repairing)

是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。光修复(lightrepairing)切除修复(excisionrepairing)重组修复(recombinationrepairing)SOS修复

修复的主要类型（一）光修复光修复酶(photolyase)

UVUvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHP

（二）切除修复是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。DNA连接酶ATPE.coli的切除修复机制目录切除修复动画着色性干皮病(XP)案例分析

着色性干皮病(XP)

此病为常染色体隐性遗传病,患者皮肤对日光敏感,病变累及颜面,肩，臂等.发病机制

XPA基因第631位碱基由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶(转换)第211位氨