胚胎移植课件

动物克隆研究现状及其展望一、国内外研究现状

（一）概述

动物胚胎工程是当今生物工程的研究热点之一，目前主要向两头延伸：胚胎工程推广应用高深研究（胚移产业化）（克隆、转基因）

分子克隆：人工扩增生物大分子

克隆（Clone）细胞克隆：细胞系

（无性繁殖）

胚胎细胞克隆

个体克隆（卵核移植）

体细胞克隆克隆源于希腊文，原意为树木的枝条，在生物学中系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称为无性繁殖系。细胞核移植技术：将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖就可被激活、分裂并发育成新的个体、使得核供体的基因得到完全复制。（二）哺乳动物胚细胞核移植胚胎细胞克隆重大进展技术基本成熟：如1枚牛胚获得了7头活牛犊。继代克隆：牛连续克隆至第7代，获得了第3代犊牛，1枚胚连续克隆获得了190枚胚胎；山羊继代克隆5代共获得了45只不同代的后代，1枚胚连续克隆获得了298枚胚胎。（类）胚胎干细胞系的建立：仅在小鼠上建立了ES系（Evans&Kaufman,1981;Martin,1981），意义很大，可用ES细胞进行核移植。1995年，英国学者Campbell等，利用9.5天绵羊胚胎滋养层细胞培养传3代后作为核供体获得了后代，曾被评为96年世界十大科技新闻之一。1999年，小鼠ES细胞克隆获得成功（Wakayamaetal.,1999），用长期培养的牛PGCs克隆后获得了一头公牛（Muelleretal.,1999）。（三）体细胞克隆进展成年体细胞：绵羊Dolly，乳腺上皮细胞，Wilmutetal.(1997)；小鼠30余只，卵丘细胞，Wakayamaetal.(1998)；牛，卵丘细胞（5），输卵管上皮（3），Katoetal.(1998)；老牛颗粒细胞（2），传代冻解，Wellsetal.(1998)；乳腺上皮原代细胞（1）与耳皮肤成纤维细胞（1），Zakhart-chenkoetal.(1999)；肌肉细胞（4），传4代，Shigaetal.(1999)；耳皮肤成纤维细胞培养3个月传15代，Kubotaetal.(2000)；山羊，张涌等（2000）；成勇等（2000）；Keeferetal.(2000)。猪，颗粒细胞核移植胚二次核移植，Polejaeveaetal.(2000)。胎儿成纤维细胞：绵羊，3只，Wilmutetal.(1997）；6只，Schniekeetal.(1997）；牛，Cibellietal.(1997);；Butler(1998)；Zakhartchenkoetal.(1999)；Vignonetal.(1999)；山羊，Baguisietal.(1999)；猪，Onishietal.(2000)。（四）哺乳类异种动物克隆研究进展指核供体细胞与核受体细胞来源于两个不同的种系。研究报导不多。尚未见有异种克隆个体产生的报导，但有一些获得异种克隆囊胚甚至胎儿的报导。大熊猫成年体细胞与去核兔卵母细胞重建得到了异种体细胞克隆囊胚（陈大元等，1999）。二、动物克隆的技术路线（一）供体核的分离技术1.胚细胞用0.2%链霉蛋白酶预处理胚胎,然后机械法剥离透明带,钝头玻璃吸管反复吹吸以分离成单个卵裂球。2.体细胞最早是用青蛙肠粘膜上皮细胞的核获得后代。Wilmut等将绵羊乳腺细胞在特定的实验条件下增殖培养6天，诱使细胞处于静止状态，以便染色质结构调整和核进行重组，从而获得了克隆绵羊“多莉”，开创了哺乳动物体细胞核移植（克隆）的新纪元。（二）受体细胞的去核技术现一般均采用超数排卵回收的卵母细胞或体外培养成熟的卵母细胞，并将其置于含细胞松弛素B和秋水仙胺的培养液中，一端用固定吸管固定，另一端用一尖头吸管（Ф30μm）穿透透明带进入卵周隙，或用一细长玻璃针刺破并切开一部分透明带，再用呈直角的去核吸管经切囗抵住细胞膜，操纵去核吸管，从第1极体外吸除第一极体及时性于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。（三）核卵重组技术在显微操作仪操纵下，用去核吸管吸取一枚分离出的完整卵裂球，注入去除核的受体卵母细胞的卵周隙中。（四）重组胚的融合技术由于微吸管破坏了卵膜及一部分细胞质，若直接移植则成功很低，故需对重组胚进行融合，现多采用电融合法,将重组胚置于融合小室内，使核一质集结面与电极相平行，在一定的电场强度下，给予一定时间的矩型直流电脉冲促使其融合。（五）核移植胚的培养与移植或重复克隆技术融合后的胚胎在体外培养或经过中间受体培养至桑椹胚或囊胚，然后移入与胚龄同期的受体动物子宫角内，可望获得克隆后代。获得的早期胚也可作为供体核重新克隆。三、意义及发展前景（一）意义为动物胚胎发生、死亡及其调控以及人的生长、衰老等研究提供研究手段。为许多研究如肝癌等提供大量遗传性状一致的动物模型。提供人体代用器官或生产大量生物药品。优秀种畜的快速纯繁扩群，加快新品种选育的进程。拯救珍贵濒危动物。（二）发展前景进展快、意义大，但还有许多问题有待解决，仍是当今生物界研究的热点。2000年武汉动物繁殖研讨会上，众多专家认为，十五期间，在胚胎移植产业化的同时，克隆、转基因、胚胎干细胞等研究将会有更大的进展，建议并相信国家会有更大强度的资助。

四、我们实验室拟开展的

研究工作

南京农业大学

动物胚胎工程技术中心去年底借搬迁实验室之际，我们对原有的胚胎室进行了扩充，面积达到了100M2，并为克隆预留了无菌室。利用学校贷款新添置了CO2培养箱、生物显微镜、电子天秤等仪器。最近校长投资50万元用于购置显微操作系统等。最近学校正式成立校级动物胚胎工程技术中心，并在为下一步申请成立省级动物胚胎工程技术作准备。目前本中心直接从事胚胎工程研究的人员有4名教师与近10名研究生。（一）胚胎干细胞系的建立胚胎干细胞具有全能性与无性繁殖两大特点，为克隆动物无限量地提供种质资源。早在80年代初世界上就已建立了小鼠ES细胞系，但其它一些动物只是建立了类ES细胞系。这次全国动物繁殖研讨会上，专家一致认为，攻克并建立ES细胞系已迫在眉睫。我们实验室已有多年从事胚胎与细胞培养的经验，以此为出发点，近期先建立类ES细胞系是完全可能的。（二）体细胞克隆的研究

克隆的目的在于大量繁殖经济价值高的良种或稀有动物。我们选择以名犬或种羊为对象，其数量少、价值高，不仅科学上有突破意义，而且为将来开发应用奠定基础。南京警犬研究所是公安部直属的、集警犬科研与养殖的大型研究所，可以为该项研究提供宝贵的种质资源。种羊可选用波尔山羊或绵羊无角道赛特等。目前先开始用兔作试验。

注核

移植

一群名犬或种羊

名犬或种羊克隆示意图卵母细胞

去核

去核卵母细胞

皮肤组织皮肤细胞体外传代

五、关于克隆人的问题

一、国内外研究现状

早在100多年前就进行过体外受精尝试；

1951年，精子获能现象的发现，是体外受精的里程碑；

50—70年代，实验动物上进行了大量研究，并取得了成功；

80年代以来，由于对胚胎需求量的加大，促进了家畜体外受精的研究，牛、绵羊、山羊、猪等相继获得了成功，国内在90年代也在家畜上取得了成功。

现已将卵母细胞体外成熟—体外受精—早期胚体外发育，甚至冷冻保存结合在一起，建立工厂化生产胚胎的成套技术，以大量生产质优价廉的胚胎。

二、卵巢卵母细胞的获得与体外成熟培养

（一）卵巢卵母细胞的获得1.活体卵巢上采集

母畜超排处理后，利用剖腹术或腹腔镜技术已能成功地采集卵泡卵母细胞。2.屠宰后卵巢上采集

(1)卵巢的采集与保存:宰后立即无菌采集,30--37度灭菌生理盐水中6H内运回实验室。

(2)卵巢表面卵泡细胞的获得

1)抽取法:18号针头;最常用;

2)剥离法:

3)切开法:3.卵巢内卵泡卵母细胞的获得

数量多，用一组特制刀片对卵巢组织进行深部切割，采卵率约提高1倍。

（二）卵母细胞的筛选

只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落（B级）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟与胚胎发育的培养。

（三）卵母细胞的体外成熟培养1.成熟培养液与培养条件

最常用的是碳酸氢钠或Hepe’s缓冲的TCM-199;

5%CO2、饱和湿度、38.5--39度，24H。2.成熟培养中添加成分的影响

1)促性腺激素与E2的影响

2)EGF的影响

3)颗粒细胞的影响:低浓度能促进成熟分裂

4)血清的影响

三、牛精子的体外获能与体外受精

（一）精子的洗涤与体外获能1.BO液类

鲜精或冻精解冻后离心洗涤约2次,每次5-10分钟,最后的精子小滴悬浮成1-10X106/ML。

常用咖啡因-肝素-BSA使精子获能。2.改良Tyrode液（TALP）类

1）上浮法

2）Percoll法

（二）体外授精授精通常在覆盖下的微滴中进行，微滴以50--100微升为宜，一般每滴中加5--10个卵母细胞，精子最终浓度为0.64--1X106个/ML5%CO2、39度培养，BO液中6-8H，TALP液中18-24H。

四、其它哺乳动物精子的体外获能与体外受精特点（一）猪鲜精或冻精用0.9%氯化钠-1mg/mlBSA洗3次，然后用改良台氏液或TCM-199液稀释至108个/ml、5%CO2、39度获能孵育60min，最后在受精液（2-10mM咖啡因、10mg/mlBSA）中授精，精子最终浓度为105

个/ml，条件为5%CO2、39度培养4-5h。（二）山羊Hanada等用钙离子载体法获能，受精率达50%，获得了世界首例试管山羊。刘灵等用肝素和BSA获能，受精率最高达89.7%，并获得了世界首例卵泡卵母细胞体外受精后代。

（三）绵羊

方法与牛相似。

五、早期胚的体外发育

不同的动物早期胚胎体外发育都存在阻断期，体外发育培养时需要一些特殊的培养条件如共同培养细胞，以克服阻断，但目前的发育率仍然比较低，约为40%，是限制体外受精应用的一个突出问题。

六、胚胎冷冻保存（一）常规的慢速冷冻法

冷冻液1.5M甘油+0.25M蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP和1.5M乙二醇+0.25蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP

冷冻步骤为：①在室温下，先将牛胚胎放入防冻液中平衡一段时间；②装管；③以每分钟0.3~0.5℃的速度降温至–35℃；④植冰；⑤平衡10分钟后，投入液氮中保存。（二）玻璃化冷冻

冷冻液：EFS40：40%乙二醇+0.3M蔗糖+18%聚蔗糖+PBSS

冷冻步骤：首先将胚胎放入20%乙二醇溶液（EFS20）中平衡5min后，用移卵管移入玻璃化溶液中平衡10min，然后装管，封口。把细管直接投入液氮冷冻保存。

七、影响体外受精的因素（一）卵母细胞的成熟度（二）精子体外获能胚胎移植及其意义国内外牛羊胚胎移植产业化进展胚胎移植的基本原则胚胎移植技术路线一、胚胎移植及其意义胚胎移植是指将一头良种母畜配种后的早期胚胎取出，移植到另一头同种且生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体的过程。实际上是由产生良种胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代的技术。意义：提高良种母畜的繁殖利用率，加快良种纯繁速度；加快品种的选育进程；代替种畜直接进口；拯救濒危动物；研究手段。

二、国内外牛羊胚胎移植产业化进展

胚胎移植技术是20世纪畜牧业中继人工授精技术之后又一次巨大变革，业已成为一项充分发挥优良母畜繁殖潜力的实用繁殖新技术。国际间胚胎贸易非常活跃，早在1994年，全世界仅胚胎移植牛就已超过350，000头，其中进出口的胚胎约占总数的10%，羊胚胎年产总量虽较低，约为牛胚胎的5-10%，但进出口比例更高。近年来，国际上胚胎的产量和贸易量则成倍增长。美国、加拿大、法国、新西兰、澳大利亚等发达国家成立了上百家胚胎移植公司；美国、法国等近年参加后裔测定的青年公牛中80%以上为胚胎移植的后代。牛羊冻胚移植的成功率达到了50-60%。我国的胚胎移植技术也已相当成熟，九五期间，全国在肉牛、奶牛上分别移植受体4955、3926头，平均妊娠率达到51.5%。去年全国通过胚胎移植获得的波尔山羊数可望达到800只以上。

三、胚胎移植的基本原则（一）胚胎移植前后所处的环境应是相同或相似的

1．供体和受体在种属上必须一致

2．供体和受体在生理上必须一致供、受体在发情时间上应同期化，一般相差不超过24h，否则移植成功率显著下降。

3．从供体中收集胚胎的部位与给受体移植胚胎的部位必须一致即从供体子宫角内收集到的胚胎应该移植到受体的子宫角内。（二）移植的时间要适宜胚胎收集与移植的时间不能超过周期黄体的寿命，因此，胚胎的收集时间不能超过发情配种后第7天，最好是在发情配种后的第5-7天内进行。

（三）胚胎的发育应当正常胚胎的收集及移植过程应当严格按照要求进行，尽量不使其受到物理、化学或生物方面的影响。同时，胚胎移植前需进行鉴定，确定其发育正常者才能进行移植。

四、胚胎移植技术路线（一）供、受体的选择供体的选择

1．供体应是良种，而且为性状表现优秀、具有较高育种价值的个体。

2．供体应健康无病，膘情中等偏上，年龄以青壮年为佳，如羊上，可选初产羊及8岁以内的经产羊作为供体。

3．供体生殖机能应处在较高水平。既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，超排处理前应有两个或两个以上的正常情期。

受体的选择

1．受体一般选用价格低廉、生产性能比较低的同种母畜。

2．受体要具有良好的健康状态，体型中上等，初产或经产青壮年母畜。检疫和疫苗接种与供体相同。

3．受体应具有良好的繁殖性能，既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，移植胚胎前应有两个或两个以上的正常情期。（二）受体的同期发情

1.前列腺素处理法PGF2α或其类似物有溶解黄体的作用，黄体溶解后，卵巢上就会有卵泡发育而发情，所以只能对于卵巢上存在黄体的受体有效。在发情周期的第九天以后，注射PGF2α

，常可在注射后2-3天内发情。在繁殖季节，如不能确定受体的发情周期，可采用两次注射法，受体第1次注射后，凡卵巢上有功能黄体的个体即可在注射后发情，选出发情个体做为受体。其他间隔10-12天第2次注射。此方法方便可靠，但费用较高。2.孕激素处理法孕酮能够抑制腺垂体释放FSH，每日肌注或口服孕酮，或经阴道海绵栓给予孕酮或其类似物，一般处理12-18天后，可以抑制卵泡发育。停止处理或撤除海绵栓后，孕酮的抑制作用消失，卵巢上即有卵泡发育，从而使受体发情。通常在停止处理或撤除海绵给后2-3天内发情。为了提高排卵的效率，在孕激素处理结束的前一天，给予小剂量的FSH是非常必要的。此法费用低，但处理时间长。(三)供体的超数排卵与人工授精在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数排卵，筒称“超排”。供体羊的超排方案：在发情周期第10、11、12天每只羊分别肌注FSH100、80、60单位，末次肌注时同时注射PG2ML/只，24H后再肌注HCG500单位。发情后供体配种2—3次。供体牛的超排方案：在发情周期第10、11、12、13天每头牛分别肌注FSH160、140、110、90单位，每天分两次注射，在第12天注射FSH的同时肌注PG，上午2支/头，下午1支/头。发情后供体配种2—3次。 (四)胚胎的收集1.冲卵液和保存液的制作冲卵液有很多种，目前最常用的为含5%犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBSS），也可用于体外短期保存胚胎。保存时间长或体外培养多用M-199液。D-PBS和M-199液或其他培养液一般都有成品出售。2.羊胚胎的回收(1)术前准备场所、器械和人员的准备供体羊的术前准备：术前一日停止喂食但不停水、术部剃毛；手术前的麻醉采用硬膜外麻醉结合局部浸润；术部皮肤先用2-4%的碘酒消毒，晾干后再用70%—75%的酒精棉涂擦脱碘。将创巾固定在术部周围并露出术部。

(2)手术过程皮肤用外科刀一次切开，4—6厘米。肌肉用钝性分离的方法沿肌纤维的走向分层切开，最后切开腹膜。切开过程中注意及时止血。手术者将食指及中指由切口伸入腹腔触摸子宫角，用二指夹持，因势利导地牵引至创口表面，先循一侧的子宫角至该侧的输卵管，在输卵管的末端弯转处找到该侧的卵巢，观察卵巢表面的排卵点和卵泡发育情况并做记录。（3） 冲洗输卵管法适宜于2--3日龄的胚胎；将一根长5~7cm，外径3~4mm的硅胶管插入输卵管喇叭口内1~1.5cm，用血管夹固定。左手掌心向上，以母指和食指捏住子宫角前端，右手持吸有冲卵液的针管并将针头插入子宫角尖端，注入冲卵液约80—100ML。（4）冲洗子宫法适宜于5--7日龄胚胎；在一侧子宫角中部大弯处用止血钳尖端刺透子宫壁，插入冲胚导管（二通式医用导液管），向导管气囊打气3—5ml。在导管顶端前方，向宫管接合部插入套管针，抽出针芯，由此向宫管部缓慢注入冲胚液30—60ml，冲胚液边注入边由导管排出，用三角瓶接收回流冲胚液。最后用手指轻轻压挤子宫角，让冲胚液完全排出。用同法冲另一侧子宫角。冲胚后将子宫角送回原处，腹腔内注入油剂氯霉素5ml，闭合腹壁。术后肌肉注射氯前列烯醇0.2ml，全身用抗菌素1日。3.牛胚胎的回收适宜于5--7日龄胚胎;

现均采用二通管非手术采卵法：用直肠把握子宫颈法插入带有探针的二通管直至一侧子宫角的基部，通过打气空注入8--10ML空气,抽出探针，通过中心管道反复注入--回收冲卵液,连续5--6次。同样方法冲另一侧子宫角。（五）胚胎的检查和评定回收到的冲洗液盛于玻璃器皿中，37℃静置10分钟，待胚胎沉降到器皿底部，移去上层液后开始检卵，检查胚胎发育情况和数量多少。在连续变倍解剖显微镜（实体显微镜）下进行检卵。胚胎的质量评定：主要采用形态学方法，优质胚胎才能用于进行胚胎冷冻或移植。（六）胚胎的移植羊采用手术法将胚胎移入输卵管或子宫角前端。牛采用非手术法，用移植枪将胚胎移入输卵管的前端。

胚胎干细胞（Embryonicstemcells，ES细胞）是一种从早期胚胎内细胞团（Innercellmass，ICM）或原始生殖细胞（primordialgermcells，PGCs）经体外分化、抑制培养、分离和克隆得到的具有发育全能性的细胞。目前，ES细胞已经引起广大学者的注意和兴趣，对ES细胞的研究也取得了很大进展。

1.ES细胞的研究概况

ES细胞研究，首先源于畸胎瘤细胞（Teratocarcinomastemcell）或胚胎瘤细胞（Embryoniccarcinomacell，ES细胞）。1958年，Steven通过把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精巢或肾脏被膜下得到了EC细胞[1]。随后，EC细胞常被用以研究哺乳类动物发育和遗传以及细胞诱导分化的实验模型，通过各种诱导因子和实验条件，成功地诱导出神经细胞、肌肉细胞、软骨细胞和上皮细胞等包括三个胚层在内的各种类型的分化细胞。1974年，Brinster把EC细胞注射到胚泡腔后，EC细胞参与受体胚胎的发育，从而得到了嵌合体。1981年，Mintz等培养的METT-1系EC细胞具有与生殖腺嵌合的能力[2]。但是由于EC细胞种系间的嵌合率低，仅有13%，而且EC细胞具有肿瘤源性，生成的嵌合体到了成年又出现肿瘤，建成的EC细胞系有异常核型。因此EC细胞作为研究正常细胞分化的模型并不理想。

1981年，Evans和Kaufman首先在EC细胞研究的基础上，通过对延迟着床的小鼠早期胚胎进行体外培养，首次分离得到小鼠ES细胞，并以两个人名字的开头字母命名为EK细胞，并建立了ES细胞系[3]。随后，人们相继建立了其它动物的类ES细胞。Doetschman(1988)、Piedrahita(1990)建立了仓鼠的ES细胞系。Notarianni(1990)、Piedrakita(1990)、Strojek(1990)、Anderson(1990)和Wheeler(1994)各自成功的建立了猪的类ES细胞系；Sukoyan(1992)建立了水貂的类ES细胞系。Saito(1992)、Strelchenko(1994)和Stice(1993)建立了牛的类ES细胞系，Sims(1993)对ES细胞进行核移植，得到四头犊牛，Cibelli用转基因技术得到了生殖系嵌合体牛。Craves(1993)、Niemann(1994)建立了兔的类ES细胞系。Tsuchiya(1994)、Meinecke、Tillmann(1996)建立了绵羊ES细胞系，Campbel于1996年对绵羊ES细胞系进行核移植，得到了四只羔羊。Bongso(1994)、Meineke-Tillmann(1996)建立了山羊的类细胞系。1994年，Bonso建立了人的类ES细胞系，1998年，Tillhomoson等建立了人的类ES细胞系，并进行了鉴定，其中，H9株传32代，并能成功地进行冷冻和解冻。该细胞的核型正常，AKP、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-18染色均为阳性，体内体外分化试验证明具有多能性[4]。

我国尚克刚（1989，1993，1994），丛笑倩（1990）也分别建立了小鼠的ES细胞系，并得到了嵌合体小鼠。1991年，陈立人建立了小鼠和猪的类ES细胞系。1995年，赖学良建立了兔的ES细胞系，并得到了一只皮毛嵌合体小鼠。1999年，张学明对利用小鼠胚胎成纤维细胞制作饲养层进行了研究，发现了2日龄到13日龄之间的小鼠胚胎最适于分离小鼠原代胚胎成纤维细胞[5]

西北农业大学，从1994年开始，用早期胚胎相继分离克隆出的类ES细胞，最多传五代（1995，1997，1999）；牛的类ES细胞，最多传六代（1995，1998，1999）；小鼠的类ES细胞，最多传九代；1997年用分离流产胎儿原始生殖细胞克隆出人的类ES细胞，最多传六代；1999年分离克隆出牛的类ES细胞，传15代，并进行了冷冻保存[6]。特别是近几年来，由于对人的类ES细胞的研究取得了很大进展，国内外掀起了一股ES细胞的研究热潮。

2.ES细胞的形态学特征及基本特征2.1ES细胞的形态学特征

ES细胞核大，胞质胞浆少，细胞界限不明显。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长，边缘折光性强，集落边缘可见有少量的已经分化为扁平上皮细胞或梭形的成纤维细胞。用碱性磷酸酶染色法染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞则呈淡黄色[7]。小鼠胚胎干细胞的直径在7-18um之间，猪、牛和羊的ES细胞颜色较深，直径为12-18um[8]。总的来说，ES细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征。2.2ES细胞的基本特征

2.2.1全能性

ES细胞的全能性（totipotenty），是指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即ES细胞发育成完整动物体的能力。其实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依此表达。ES细胞是能在体外大量增殖的全能性细胞，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实验材料。ES细胞全能性的检测方法是以胚胎干细胞进行细胞核移植。如果ES细胞能和去核的细胞融合发育成重构胚，而且经过胚胎移植，重构胚能发育形成个体，则表明ES细胞具有全能性。例如，Campkell将绵羊的类ES细胞注射到去核卵母细胞中，获得重构。重构胚经过胚胎移植，有活的羔羊产生，证明了绵羊的类ES细胞具有发育全能性[9]。2.2.2多能性

多能性（Pluripotency）是指ES细胞具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成。细胞多能性检测的方法很多，主要有：1.体外培养诱导分化试验将ES细胞培养在不含分化抑制物的培养基上，可以形成类胚体（Embryoidbodies）。2.将ES细胞在特定培养基进行培养，定向分化成特定组织。例如，在含有白血病抑制因子（LIF）和维生素A酸（RA）的培养基可以分化形成体壁内胚层。3.将ES细胞悬液（1-2×107个/ml）注射入同原动物皮下，形成组织瘤，可以形成内胚层，中胚层，外胚层。4.胚胎嵌合法，将ES细胞与胚胎细胞共同培养或者将ES细胞注射入囊胚腔中，ES细胞就会参与多种组织发育。如Kaufman首次用小鼠ES与囊胚嵌合，获得了第一个生殖腺嵌合体小鼠，表明ES细胞具有发育多能性。

利用骨髓基质细胞或其条件培养液，可诱导ES细胞在体外分化为造血干细胞（transforminggrowthfactorB，TGF-B）的ES细胞，在维甲酸（RA）培养液经悬滴培养形成抑胚体，再继续贴壁培养，可见拟胚体周围有许多由内皮细胞排列而成的辐射状血管样结构；ES细胞在RA与双丁酰基环腺苷磷酸（dibutyrylcyclicadenosinemonohosphatedBcAmp）共同作用下，可以分化为神经胶质细胞；在RA诱导下，ES细胞可分化为肌细胞；ES或EG细胞经悬滴培养形成的拟胚体在二甲基亚砜（DMSO）、胰岛素，三碘腺原氨酸（triiodofhgronine）、胎牛血清或维甲酸（RA）的共同作用下可分化为脂肪细胞；ROSAB-geo基因传染的ES细胞在缺乏G418、含有10%小牛血清，1umol/L低塞米松（dexamethason）条件下可以分化成软骨细胞[10]。

此外，也可以通过测定时期专一性胚胎抗原（stage-specificembryonicantigenSSEA）.碱性磷酸酶（AKP）、OCT-4基因、端粒酶（telomerase）等发育全能性标志来确定。ES细胞表达SSEA，因此常用单克隆抗体SSEA-1检测ES和EG细胞表面抗原作为发育全能性的标志。ES和EG等未分化干细胞具有较AKP高的活性。而在已分化的细胞中，活性则明显降低。OCT-4是一种发育全能性的标志基因，在小鼠胚胎发育早期，生殖细胞谱系以及体外培养的多能干细胞都能特异性的表达OCT-4基因，而分化细胞则无OCT-4基因表达。端粒酶是一类核糖糖蛋白，与维持真核细胞染色体末端的端粒长度以及控制细胞寿命有关。人ES细胞端粒活性很高，而分化细胞则一般难以检测到其活性[11]。

3.ES细胞系的建立概况及建系的技术要点：3.1ES细胞系的建立概况

迄今为止，小鼠与人的ES细胞系已经成功建立，其他动物如仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊的类ES细胞系也相继建立，在牛、兔上还得到了转基因嵌合体动物[12]。

3.2ES细胞建系的技术要点

ES细胞建系的原理是将早期胚胎（桑椹胚或囊胚）或者是用外科手术法得到的内细胞团（Innercellmass，ICM）或者原始生殖细胞（primordialgermcells，PGCs）与分化抑制物共同培养，使之增值而又保持未分化状态，这样代代相传，从而使数量有限的胚胎或者PGCs细胞能够成千上万倍地克隆。其建系的基本技术要点如下：

3.2.1饲养层的制备及分化抑制物的选择

常用的饲养层是由小鼠成纤维细胞无限系（STO）或小鼠原始胚胎成纤维细胞（PMEF）制备而成，STO或PMEF经过丝裂霉素C等有丝分裂抑制剂处理后，与早期胚胎或PGCs共同培养后，ES细胞就可以分离出来了。STO和PMEF细胞可以分泌成纤维细胞生长因子FGF（fibroblastgrowthfactor）、分化抑制因子LIF(leukemiainhibitoryfactor)，这些因子有助于ES细胞增值，而且能抑制细胞的凋亡和分化。此外，也可以用绵羊、山羊的输卵管或子宫上皮、牛的颗粒细胞、子宫成纤维细胞等作为分化抑制培养基[13]。3.2.2早期胚胎及PGCs的选择和分离

以下早期胚胎都可以作为建立胚胎干细胞系的材料：小鼠的桑椹胚（2日龄），囊胚（3日龄）和延迟囊胚（4-6日龄）；猪的囊胚（7-10日龄）；绵羊的囊胚（7-9日龄）；山羊的囊胚（7-8日龄）；牛的桑椹胚（6-7日龄），囊胚（7-8）日龄；兔的囊胚（4-5日龄）；水貂的囊胚（8-10日龄）；仓鼠的囊胚（3日龄）。3.2.3早期胚胎及PGCS的培养和ES细胞的分离传代

将早期胚胎或PGCs置于饲养层或条件培养基上，在5%CO2、37~39℃条件下进行培养。培养液一般为DMEM+15%胎牛血清（FCS）。培养液中可添加多种细胞因子或分化抑制物，如分化抑制因子（LIF）、表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、β—硫基乙醇（mercaptoethanol）等。

进行体外培养时，当胚胎内细胞团ICM增殖后或PGCS出现ES样克隆后即可传代。ES细胞的增殖速度很快，小鼠ES细胞每7-8小时倍增一次，猪类ES细胞每20小时倍增一次，羊类ES细胞，每40-50小时倍增一次，牛类ES细胞每18-24小时倍增一次14。传代时一般是用胰酶EDTA消化，在用微吸管或拨针将其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层上，进行培养几天后，即可出现新的克隆点，在其分化之前可以再进行传代。3.2.4ES细胞的鉴定及保存

ES细胞的鉴定方法主要有形态学鉴定，碱性磷酸酶（AKP）染色，表面抗原检测，核型分析，体外分化实验，嵌合体实验，核移植等。

ES细胞保存方法一般是冷冻保存，比早期胚胎的冻存技术要简单一些。冷冻保护液一般为DAEM+30%-50%NBCS（新建牛血清）+10%DMSO（二甲基亚砜）。冷冻过程为：室温下平衡10分钟→10℃冰箱3-5小时→-7℃冰箱过夜→第二天放入液氮中长期保存，也可以-70℃冰箱保存几个月。解冻一般在37℃水浴中进行，解冻后立即用新的培养液替换冷冻保护液，随后转入CO2培养箱中进行培养。4.ES细胞的应用及前景ES细胞特有的生物学特性,决定了其在生物学领域有着不可估量的应用价值.在进行ES细胞建系和定向分化的同时,在核移植,嵌合体,转基因动物研究等方面也进行了广泛的尝试,已经充分体现出ES细胞在加快良种家畜繁育,生产转基因动物,哺乳动物发育模型,基因和细胞治疗等方面有着广阔的应用前景.

4.1ES细胞与动物克隆

ES细胞具有可以无限地传代增殖，而且不改变其基因型和表现型的特点。如果以ES细胞作为核供体进行核移植,可以在短时间内获得大量基因型和表现型完全相同的个体。而且用ES细胞与胚胎进行嵌合克隆动物,可以解决哺乳动物远缘杂交的困难,生产出珍贵的动物,也可以进行异种动物克隆,有助于保护珍惜野生动物.自绵羊“多莉”出世后，许多科学家对体细胞克隆进行了大量的试验，并取得了成功。但是，尽管体细胞克隆与ES细胞克隆相比有着易于取材的特点，但是体细胞克隆也存在着不少缺点，如生理和免疫缺陷，目前体细胞克隆还不能完全代替ES细胞克隆。4.2基因载体

目前常用的生产转基因动物的方法是向受精卵中注射DNA，外源基因的整合、表达和筛选工作是在个体水平上进行的，不仅工作繁琐，周期长成功率低，产生的后代的遗传性状也常出现分离；而利用ES细胞作为基因载体，得到基因整合的细胞，将载体ES细胞直接进行核移植或者通过与胚胎嵌合获得嵌合动物，ES细胞在嵌合体中分化发育成全能性的生殖细胞，即可以得到携有目的基因的转基因动物。因为一个优良的ES细胞系不仅可以用于各种目的基因转化，用各种方法将外源DNA导入细胞，而且外源基因的整合数目、位点、表达程序以及稳定性等都可以在细胞水平上进行加工，筛选，在很大程度上加快了动物遗传工程的进程。现在已经有不少有关以ES细胞作为外源基因载体生产转基因动物的报道。Hooper用逆转录病毒DNA随机插入和同源重组法得到了次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）缺失的ES细胞系，并获得了HPRT缺失的嵌合体小鼠，建立了猪TGF-B1cDNA的ES细胞。曾讳清将HGF基因导入小鼠ES细胞，获得了转染HGF基因的ES细胞。

一、加强饲养管理

二、推广人工授精与同期发情技术

（一）准确发情鉴定与同期发情处理

（二）适时配种

（三）优质良种精液

（四）改善人工授精配种技术，严把无菌关

（五）提高情期受胎率

三、加强对围产期疾病的防治

四、双胎技术

五、不孕症的治疗

（一）卵巢机能减退

（二）持久黄体

（三）卵巢囊肿

（四）排卵障碍

一、概述

转基因技术就是把某一特殊基因从动物细胞中分离出来，或人为构建外源目的基因，然后再将其转移至另一动物的生殖细胞或早期胚胎，使其稳定地整合到动物基因组中，并使该动物获得前者的遗传性而且能遗传给后代，从而改变动物品种，获取人类所需的特殊物质。利用该项技术获得的动物就是转基因动物。

1968，鸡；

1974，鼠；

1982，超级小鼠；

1994，超级猪；

现已获得了多种基因、多畜种、