从MISEV2023中寻找外泌体标志物 WB阴性的解决方案

从MISEV2023中寻找外泌体标志物WB阴性的解决方案作者：绿野目前，细胞外囊泡（EVs）的发展如火如荼，EVs的命名、分离、表征、功能研究和临床转化等方面仍存在诸多挑战。为应对这一快速发展领域的挑战和机遇，国际细胞外囊泡学会(ISEV)发布了最新版的MISEV。MISEV2023汇编了来自ISEV专家工作组和1000多名研究人员的反馈，为研究人员提供了最新的研究方法和指导原则，推动该领域更快地向前发展。众所周知，无论哪种外泌体分离方法都很难获得十分纯净而且单一的外泌体样品，因此需要对收集的外泌体样本进行鉴定。常见鉴定方法，除了电镜鉴定形态、粒径分析技术检测粒径分布和浓度之外，还要结合WesternBlot等技术进行外泌体标志物蛋白检测。本文我们试图对国人外泌体研究中遇到的最基础也是最麻烦的问题：利用Westernblot（WB）鉴定外泌体标志物经常获得阴性结果的问题在MISEV2023中寻找答案，并总结一些解决方案。MISEV2023正文中指出：目前，没有通用标志物可以识别所有EV。虽然之前已经提出了几种蛋白质作为EV生物发生途径的假定标志物（例如AnnexinA1、SLC3A2、BSG和Lamp1等），但这些标志物的普遍性尚不清楚或未被接受。需要注意的是，涉及四跨蛋白CD9、CD63和CD81的基于亲和力的富集方案对于外泌体而言不是特异性的，并不是所有的EV都会显示这些蛋白。图1MISEV2023对外泌体标志物的描述MISEV2023建议继续使用MISEV2018中的五大类标志物蛋白进行EV表征。第1类和第2类蛋白用于评估EV的存在，第3类蛋白主要用来进行EV纯度评估，第4类和第5类蛋白可提供EV细胞内起源或共分离物的额外信息，建议选择前3类蛋白中每个类别至少一种蛋白作为EV标志物。表1基于蛋白质的EV表征MISEV2023的内容或可一定程度上解释为什么WesternBlot实验有些时候无法检出外泌体蛋白标志物。总体而言，综合文献和项目经验，小编认为可汇总为以下几点：检测指标。外泌体表面没有表达/显示CD9、CD63、CD81等标志物蛋白，常用的标志物指标不具备通用性。EV异质性。该特性在体液样本中尤为突出，其收集的EV有明显异质性特点（来源异质性、尺寸异质性、携带内容物异质性和功能异质性），不同的EV表面标志物表达各不相同。EV纯度。不同EV提取方法各有利弊，例如分别使用密度梯度离心和PEG沉淀法从相同样本中收集EV，前者纯度更高。在等蛋白量上样进行WesternBlot实验的时候，密度梯度离心法制备的EV样本可能有效的EV蛋白量更多，更容易出现标志物阳性检出结果。实验过程。以经典WesternBlot为例，一些实验耗材（如抗体）及实验参数等都有可能影响最后检测结果，建议添加阳性样本以排除由于实验过程失误导致的阴性结果。检测技术。常见EV表面标志物检测技术有：WesternBlot、纳米流式、免疫胶体金、ELISA等，不同技术的检测原理、灵敏度、准确性等各有不同，可能会影响结果呈现。目前，对于EV蛋白标志物检测部分，大部分文章中呈现的还是WesternBlot数据，其实纳米流式不仅可以用于EV粒子浓度和粒径分布检测，其用于EV标志物检测也不失为一种好的补充方案。早在2019年，一篇发表在国际外泌体顶级期刊JournalofExtracellularVesicles上的文章已经通过纳米流式等技术分析了六种EV分离方法的质量和效率（TianY,etal.,2019），纳米流式分析结果直接且有结论性。图2EV标志物检测而且有很多文献在外泌体蛋白标志物（如CD9、CD63和CD81）的鉴定环节仅用纳米流式技术，不再使用WB（ZhanX,etal.,2022；LinZ,etal.,2023；LiaoM,etal.,2024）。图3文章中基于纳米流式的EV标志物检测结果此外，还有很多文献同时应用了WesternBlot和纳米流式两种技术对外泌体标志物蛋白进行检测（YangL,etal.,2022；ChenJ,etal.,2022；GuZ,etal.,2022；ShengB,etal.,2023；WilliamsS,etal.,2023）。大部分文献的数据显示纳米流式和经典WesternBlot结果具有一致性。图4文献中同时基于WesternBlot和纳米流式的EV标志物检测数据同时，我们还发现了几个有意思的现象：纳米流式总会有阳性结果，其原因大致因为纳米流式是对单个外泌体进行独立检测，不像WesternBlot一样会受到杂蛋白的影响而降低上样孔中有效EV蛋白量的占比，因此更容易出现阳性结果。纳米流式的结果显示出的外泌体的经典蛋白标志物在实测样本中的占比并不高，大部分在10%以下，这就解释了为什么研究人员通过WesternBlot实验经常不能获得阳性结果的原因，也解释了为什么MISEV2023作为外泌体研究指南要增加相关内容的描述。最后，对于外泌体标志物WesternBlot检测结果不理想的情况，华盈生物给出以下参考解决方案：1、提取方法的优化。如果条件允许，可采用纯度更高的外泌体提取方案，降低外泌体提取阶段引入的杂蛋白等污染，从而将样本问题对后续WesternBlot结果的负面影响最小化。2、WesternBlot实验优化。首先，添加阳性样本以排除由于实验过程失误导致的阴性结果，保证最优的实验条件，进行上样量增加等步骤优化。其次，由于CD9、CD63、CD81等标志物蛋白可能不具备通用性，可以尝试增加或改变标志物靶标以获得最优实验结果。最后，如果阳性条带很浅可通过延长曝光时间或增加上样量获得最优实验结果。（3）更换检测方案，如纳米流式。纳米流式用于EV粒子检测和标志物检测，结果直接且有结论性，可作为独立的鉴定方法被文献采用。华盈生物——打造血液标志物研究系统性方案1）“蛋白芯片”和“蛋白质谱”双平台技术服务体系，完美助力血液蛋白标志物的发现，双管齐下，减少血液低丰度蛋白的漏筛，发现最具临床意义的标志物。2）“外泌体研究体系”实现了外泌体“分离—鉴定—标志物筛选—验证—建模”一站式服务体系，可全面筛选血液外泌体中的RNA、蛋白、脂类等，在房水、龈沟液等超微量样本外泌体、菌群外泌体及单外泌体蛋白组检测方面更具特色和优势。3）“20k人类蛋白组芯片”包含大约2万多种人类全长蛋白质，可全面筛选血液自身抗体，发现肿瘤、自身免疫疾病等新的自身抗体诊断标志物。4）“CyTOF质谱流式”可支持全血样本、组织样本、单细胞悬液等多种样本类型的分析，抗体库包含常用的人源抗体500多种，鼠源抗体300多种，能够实现对各类细胞亚型、细胞功能的精准分析。5）“空间单细胞蛋白组”在空间维度上对单细胞进行分析，通过细胞的空间分布和细胞间的互作关系，发现与病理发展紧密关联的细胞亚群标志物。6）“ISOP单细胞功能蛋白组”可对单个细胞分泌的32种功能蛋白进行逐一检测，发现同类细胞中处于不同功能状态的细胞亚类，作为抗体药治疗和CAR-T/NK细胞治疗等肿瘤治疗的伴随诊断标志物。多年来华盈生物服务客户已经覆盖国内各大著名的高校院所和多位院士课题组。华盈的专业和专注也已获得业界普遍认可，合作者的科研成果也先后在CancerCell、PNAS、JClinInvest、NatCommun、JHepatol、SciTranslMed、Circulation等著名期刊上发表。业务咨询400-869-2936微信同号）相关文献WelshJA,etal.Minimalinformationforstudiesofextracellularvesicles(MISEV2023):Frombasictoadvancedapproaches.JExtracellVesicles.2024.TianY,etal.Qualityandefficiencyassessmentofsixextracellularvesicleisolationmethodsbynano-flowcytometry.JExtracellVesicles.2019.LinZ,etal.CirculatingMiRNA-21-enrichedextracellularvesiclespromoteboneremodelingintraumaticbraininjurypatients.ExpMolMed.2023.LiaoM,etal.ExosomalmicroRNAprofilingrevealedenhancedautophagysuppressionandanti-tumoreffectsofacombinationofcompoundPhyllanthusurinariaandlenvatinibinhepatocellularcarcinoma.Phytomedicine.2024.ZhanX,etal.SmallRNAsequencingandbioinformaticsanalysisofRAW264.7-derivedexosomesafterMycobacteriumBovisBacillusCalmette-Guérininfection.BMCGenomics.2022.WilliamsS,etal.Comparisonofextracellularvesicleisolationprocessesfortherapeuticapplications.JTissueEng.2023.ChenJ,etal.ComparisonoftheVariabilityofSmallExtracellularVesiclesDerivedfromHumanLiverCancerTissuesandCulturedfromtheTissueExplantsBasedonaSimpleEnrichmentMethod.StemCellRevRep.2022.YangL,etal.Plasma‑derivedexosomalpyruvatekinaseisoenzymetypeM2acceleratestheproliferationandmotilityofoesophagealsquamouscellcarcinomacells.OncolRep.2022.ShengB,etal.Diagnosispotentialofsubarachnoid