TNAIA 0253-2023 牛产气荚膜梭菌病的诊断与防控技术规程

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T/NAIA团 体 标 准T/NAIA0253-2023牛产气荚膜梭菌病的诊断与防控技术规程TechnicalprotocolforthediagnosisandpreventionofClostridiumperfringensofbovine2023-12-18发布 2023-12-31实施宁夏化学分析测试协会 发布T/NAIA0253-2023T/NAIA0253-2023前言GB/T1.1-20201定起草。本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。本文件起草单位：宁夏农林科学院动物科学研究所、宁夏大学、宁夏职业技术学院、贺兰县农业农村局、同心县科技服务中心。毛磊、施安、康晓冬、高海慧、张久盘、于有利。本文件为首次发布。牛产气荚膜梭菌病的诊断与防控技术规程范围本文件规定了牛产气荚膜梭菌病的诊断与防控技术的术语和定义、诊断和防控措施。本文件适用于牛场产气荚膜梭菌病的综合防控。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.13食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB18596畜禽养殖业污染物排放标准NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件。Clostridiumperfringen又名魏氏梭菌（Clostridium为梭状芽胞杆菌属，是厌氧、无动力、能产生芽胞的兰氏阳性饮水而引起动物感染发病。Clostridiumperfringentoxins产气荚膜梭菌引起动物发病的因素主要由其分泌的毒素所致，根据其产生的毒素种类α、β、ι、ε、CPE、NetB，可将产气荚膜梭菌分为A~G七种类型，其中对人和动物致病的主要是Ａ型（产生α毒素，部分菌株还产生肠毒素CPE），主要引起食物中毒和坏死性肠炎，甚至可以引起肠毒血症，造成重大影响。汹涌发酵（stormyfermentation）产气荚膜梭菌在牛奶培养基中能分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，同时产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，并将液面上的凡士林层向上推挤，甚至冲开管口，气势凶猛，是此菌的特征。爛 爛诊断流行病学饮食改变以及天气变化而发生变化菌群大量繁殖并产生相应的毒素，致使动物发病。临床症状胃和网胃积食严重，皱胃严重扩张。病理变化黑色稠状液体。病原学检测样本采集按照NY/T541规定执行。分离培养（0.5cm×0.5cm×0.535%脱纤维羊血的豆粉固体培养基（A.1）3个产气荚膜梭菌显色培37℃24h℃24h溶血；梭菌显色培养基上出现若干单个橙红色菌落。显微镜观察蓝紫色、单个或者成对排列的革兰氏阳性菌。牛乳汹涌发酵5%脱纤维羊血固体培养基上的单菌落，加入含铁牛乳培养基（A.2）中，将凡士林37℃24h的凡士林向上推挤，气势凶猛，呈现出“汹涌发酵”的现象。PCR鉴别诊断PCR扩增模板制备取液体培养物2mL，12000r/min离心2min，使用细菌基因组DNA提取试剂盒对菌体沉淀进行基因组DNA的提取。PCR引物及退火温度表1毒素基因的PCR扩增引物序列 基因引物引物序列(5’→3’)片段大小/bp退火温度/℃Cpacpa-FGCTAATGTTACTGCCGTTGA32552.6cpa-RCCTCTGATACATCGTGTAAGCpbcpb-FACTATACAGACAGATCATTCAACC23652.6cpb-RTTAGGAGCAGTTAGAACTACAGEtxetx-FAGTATCTAATGAAATGTCCATTCC58552.6etx-RACTTACTTGTCCTACItxitx-FACTACTCTCAGACAAGACAG44552.6itx-RTTTCCTTCTATTACTATACGnetBnetB-FATTATGTTTAGGAATACAGTTA74154netB-RCAATACCCTTCACCAAATACTCCpecpe-FGGAGATGGTTGGATATTAGG23354cpe-RGGACCAGCAGTTGTAGATAPCR扩增产物处理PCR1%DL1000DNAV35min左右，用凝胶成像系统照相记录结果。结果判定爛 爛符合4.1、4.2和4.3的特征判断为疑似病例。4.44.5的特征判断为确诊病例。4.5.3CpaACpa、Cpb、EtxBCpaCpbC型产气荚CpaEtxDCpaItxE型产气荚膜CpaCpeFCpanetBG型产气荚膜梭菌。防控措施疫苗接种防疫成年牛春秋季节采用牛产气荚膜梭菌疫苗进行免疫预防；犊牛断奶后采用牛产气荚膜梭菌疫苗进行免疫预防。加强饲养管理3%5%GB1859616548的要求进行无害化处理。附录A（规范性）培养基配制A.15%脱纤维羊血豆粉固体培养基1