1.2.2微生物的选择培养和计数（原卷版）

第1章发酵工程第2节二、微生物的选择培养和计数学习目标必备知识一、微生物的选择培养二、微生物的数量测定三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数拓展延伸高考链接模拟演练阐明微生物选择培养的原理2.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数一、微生物的选择培养1.选择培养基（1）概念：允许的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基（2）原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时其他微生物的生长。2.自然界中目的菌的筛选（1）实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的中提取出来的。3．微生物的选择培养(1)方法：对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的培养基上。(2)稀释涂布平板法的操作过程①系列稀释操作a．编号为1×102～1×107试管中分别盛有9mL。b．将g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。c．取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。②涂布平板操作A.取菌液：取0.1mL菌液，滴加到表面B.涂布器消毒：将涂布器浸在盛有的烧杯中C.涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器后，再进行涂布D.涂布平板：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀(3)培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板，放入30～37℃的中培养1～2d。微生物的数量测定1.稀释涂布平板法①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少。②计数原则：一般选择菌落数为的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出。③计算公式每克样品中的菌株数＝eq\f(某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,涂布平板时所用的稀释液的体积mL)×稀释倍数2.显微镜直接计数法一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是的总和。三、微生物的纯培养1.实验原理：①土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成。②配制以为唯一碳源的培养基，能够在该培养基中生长的细菌就是能分解尿素的细菌2．实验设计(1)土壤取样①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。②取样部位：距地表约的土壤层。(2)样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放一点。(3)微生物的培养与观察①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养和培养时间。细菌一般在℃的温度下培养。②观察a．观察方法：每隔h统计一次菌落数目，选取时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。b．记录菌落的特征：包括菌落的、和等。3．操作提示(1)无菌操作：取土样的用具在使用前都需要。(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的等。(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。4.实验结果分析与评价内容现象结果分析是否有杂菌污染对照组的培养基上无菌落生长对照组的培养基上有菌落生长选择培养基是否具有筛选作用选择培养基上的菌落数目明显少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目。选择培养基具有筛选作用样品的稀释操作是否成功得到的菌落数为30~300的平板操作成功重复组的结果若选取的是同一种土样，统计的结果应该接近5.菌种鉴定：分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的增强，在以尿素为唯一氮源的培养基中加入，培养某种细菌，若指示剂，可确定该种细菌能够分解尿素。1．稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的比较项目稀释涂布平板法显微镜直接计数法主要用具培养基等显微镜、血细胞计数板或细菌计数板等计数依据培养基上的菌落数菌株本身优点计数的都是活菌计数方便、操作简单缺点操作复杂、有一定误差死菌、活菌都计数在内2．选择培养基的类型类型条件分离得到的菌种改变培养条件70～80℃的高温水生栖热菌添加某种化学物质加入青霉素酵母菌、霉菌等真菌高浓度食盐金黄色葡萄球菌特殊碳源、氮源石油是唯一碳源能消除石油污染的微生物营养缺陷不加碳源自养型微生物不加氮源固氮菌3.两种纯化方法的比较项目平板划线法稀释涂布平板法主要步骤接种环在固体培养基表面连续划线等比稀释操作和涂布平板操作接种工具接种环涂布器单菌落的获得从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落用途分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落；②用于计数菌落分布共同点都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征4.选择培养基与鉴别培养基项目选择培养基鉴别培养基特殊成分加入某种化学物质加入某种指示剂或化学药品目的抑制或阻止其他微生物生长，促进目的微生物生长与微生物的代谢物或培养基中的成分发生特定反应用途培养、分离出特定微生物鉴别不同的微生物举例培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并有金属光泽)【例1】（2023·辽宁·统考高考真题）细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度（菌落数/m³）。下列叙述错误的是（

）A．采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理B．细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置C．同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值D．稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高【变式11】（2023·江苏·统考高考真题）下列关于细菌和酵母菌实验的叙述正确的是（）A．通常酵母菌培养基比细菌培养基有更高的碳氮比B．通常细菌的生长速度比酵母菌快，菌落比酵母菌落大C．通常细菌培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌，酵母菌培养基用过滤除菌法除菌D．血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定【变式12】（2023·广东·统考高考真题）研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线（如图）和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是（

）A．a点时取样、尿素氮源培养基B．b点时取样、角蛋白氮源培养基C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基D．c点时取样、角蛋白氮源培养基【例2】（2023·山东·高考真题）平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是（

）A．不含氮源的平板不能用于微生物培养B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物【变式21】（2022·江苏·统考高考真题）下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是（

）A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌【变式22】（2022·湖南·高考真题）黄酒源于中国，与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒。发酵酒的酿造过程中除了产生乙醇外，也产生不利于人体健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素与乙醇反应形成，各国对酒中的EC含量有严格的限量标准。回答下列问题:(1)某黄酒酿制工艺流程如图所示，图中加入的菌种a是，工艺b是（填“消毒”或“灭菌”），采用工艺b的目的是。(2)以尿素为唯一氮源的培养基中加入指示剂，根据颜色变化，可以初步鉴定分解尿素的细菌。尿素分解菌产生的脲酶可用于降解黄酒中的尿素，脲酶固定化后稳定性和利用效率提高，固定化方法有（答出两种即可）。(3)研究人员利用脲酶基因构建基因工程菌L，在不同条件下分批发酵生产脲酶，结果如图所示。推测是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素，理由是。(4)某公司开发了一种新的黄酒产品，发现EC含量超标。简要写出利用微生物降低该黄酒中EC含量的思路。1．微生物合成的油脂是制备生物柴油的新型原料。为筛选出产油脂的细菌，某小组进行了如图所示的实验。物质甲可将菌体内的油脂染成黑色。下列分析正确的是（）A．应将土壤菌液系列稀释、灭菌后再涂布到培养基A上B．培养基A、B、C都以油脂作为唯一的碳源C．培养基B中的菌落2和菌落4是产油脂的目的菌D．挑选培养基B中的目的菌接种到固体培养基中扩大培养2．尿酸氧化酶能分解尿酸（C5H4N4O3）。为获取尿酸氧化酶高产菌株用以研制治疗高尿酸血症的酶类药物，科研人员从某泥土中取样后富集培养，3天后吸取培养液梯度稀释到106，然后接种到固体培养基上分离培养。挑取单菌落检测尿酸氧化酶的酶活力（用每分钟转化1μmol尿酸所需要的酶量表示），结果如表所示。下列最适合作为实验目的菌落的是（

）菌落1234酶活力100501420A．菌落1 B．菌落2 C．菌落3 D．菌落43．下列有关微生物培养的叙述，错误的是（

）A．涂布接种时，需将涂布器沾酒精后在酒精灯外焰上引燃，冷却后再使用B．分离计数时，可用稀释涂布平板法对需计数的微生物进行分离C．观察菌落时，不需要将培养皿盖拿掉D．培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利4．物质Y是一种会污染土壤的含氮有机物，Y在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解Y的细菌。在筛选目的菌的培养基中观察到几个菌落（如图所示）。下列相关叙述正确的是（

）A．应首选菌落①中的菌株进一步纯化B．将所选取土壤灭菌后用无菌水稀释涂布于培养基C．图中菌落都具有能够降解Y的能力D．图中培养基可用牛肉膏、蛋白胨配制5．黄河入海口石油降解菌的筛选是修复石油污染，保护黄河的重要工作，如图表示筛选石油降解菌的过程。下列叙述正确的是（

）A．图示接种方法为稀释涂布平板法，据结果推测1g土壤中石油分解菌数最多为1.6×106个B．分离、纯化石油分解菌时，还可采用平板划线法且该方法也需要进行③步骤操作C．稀释涂布时，利用涂布器从盛有菌液的试管中蘸取菌液，进行涂布D．进行步骤⑤时，应用液体培养基培养④中的石油降解菌，并检测菌的数量和石油降解能力6．为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述正确的是（

）A．采样时只需采集植物园中某一地点的土壤样本B．活细菌数目可通过稀释涂布平板法和平板划线法来测定C．土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落D．可根据菌落的颜色、形态和大小来初步鉴定细菌种类7．下列有关微生物培养与应用技术的叙述，正确的是（）A．培养微生物所用的培养基中都必须含有水、无机盐、碳源和氮源等基本营养成分B．若要检测饮水机的直饮水中大肠杆菌是否超标,待检测水样需要经过灭菌后再检测C．采用稀释涂布平板法接种后,不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单菌落D．分离土壤中分解尿素菌纯培养后,利用含酚红的尿素培养基可作进一步鉴定8．以下说法正确的是（

）A．土壤中的尿素分解菌之所以能分解尿素是因为它们能合成尿素酶B．用尿素为唯一氮源加入酚红指示剂的培养基，培养细菌后指示剂变成红色C．用尿素为唯一氮源的培养基加入酚红指示剂的目的是做细菌的营养成分D．检测土壤中细菌总数的操作时，应选择菌落数在300以上的实验组进行计数9．下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，正确的是（）A．实验中采集的土样经高温灭菌后，可以用于制取土壤稀释液B．测定土壤样品中的活菌数目，常用显微镜直接计数法C．分离土壤中能分解尿素的细菌时，应选择以尿素为唯一氮源的培养基D．若实验组菌落平均数为37个/平板，空白对照平板上有3个菌落，则本组菌落数的平均值为34个/平板10．如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图。下列叙述错误的是（

）A．步骤②的液体培养基含有的唯一氮源是尿素B．步骤③的平板培养基是加入了适量尿素的LB固体培养基C．步骤③采用稀释涂布平板法接种，期待获得能分解尿素细菌的单菌落D．步骤④挑取③中菌落分别接种，可通过溶液pH的变化比较细菌分解尿素的能力11．尿素含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥，进入土壤能被某类细菌分解。研究人员拟从土壤中分离该类细菌并大量培养，操作流程如下图。下列相关叙述正确的是（

）A．不同的微生物均选104、105、106倍的土壤稀释液进行平板培养B．为了确保结果准确，对每个平板的菌落都要计数并取平均值C．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可以初步鉴定尿素分解菌D．④每次划线前都需要灼烧接种环，其目的都是防止杂菌污染12．某生物兴趣小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验，具体操作流程如图所示。下列相关叙述错误的是（

）A．振荡的目的是增加尿素分解菌的浓度B．纯化培养阶段使用选择培养基，应以尿素为唯一氮源C．中间试管涂布的3个平板的菌落平均数大于160个D．由图中数据可知土样中的菌株数约为个13．幽门螺杆菌是一种致病菌（该菌对万古霉素、两性霉素B等抗生素不敏感，对青霉素高度敏感），其危害主要是引起胃黏膜的炎症，形成急慢性胃炎及消化道溃疡。体检时可通过14C尿素呼气实验来检测幽门螺杆菌感染情况。受试者口服14C标记的尿素胶囊后，定时收集受试者呼出的气体并测定其中是否含有14CO2以及量的多少，作为诊断指标。请回答下列问题：(1)幽门螺杆菌能够以14C标记的尿素为氮源，是因为其能产生，若要将提取的幽门螺杆菌进行扩大培养，配制培养基将仅允许幽门螺杆菌生长，同时抑制其他微生物生长，因此，该培养基又称为培养基。(2)医生为准确测定患者胃内的幽门螺杆菌数量，采取下列图示方法进行计数，此方法常用到的接种工具是，已知步骤④获得的三个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。则1ml胃液提取物中平均幽门螺杆菌数量约为个，该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，其原因是。(3)经测定患者胃液中的幽门螺杆菌呈阳性，医生提供的治疗方案是患者需连续服用（填抗生素名称）两周至14C检测呈阴性后停药。研究表明，幽门螺杆菌可以通过消化道传染，为避免传染给他人，医生还建议患者就餐时。14．人体每天产生的尿酸有2/3通过肾排出，其余1/3则通过肠道排泄，其中肠道菌群对尿酸的代谢起着重要作用。利用肠道细菌降解尿酸可为高尿酸血症的治疗提供新思路。回答下列问题。(1)研究人员需要从（填“高”或“低”）尿酸人群的粪便中采集标本，制备成菌液保存。要测定菌液中细菌的数目，可在显微镜下用计数板直接计数；除此之外还可以采用，该方法的测量值与实际值相比一般会偏小。(2)本实验用到的尿酸选择培养基需要进行（填灭菌方式）处理；培养皿需要进行（填灭菌方式）处理。(3)高效尿酸降解菌的驯化过程采用浓度梯度法把菌液分别接种于不同浓度尿酸（1.7mmol/L，