SNT5742-2023 鱼类及其制品中金枪鱼鳕鱼和虹鳟鱼成分快速检测方法PCR试纸条法

ICSCCSX中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5742—鱼类及其制品中金枪鱼、鳕鱼和虹鳟鱼成分快速检测方法PCR—试纸条法RapiddetectionofThunnus,GadusandOncorhynchusmykissingredientinfishandfishproducts—PCR—Lateralflowdipstick 2024-07-01实中华人民共和国海关总 发 GB/T1.12020《标准化工作导1I本文件描述了鱼类及其制品中金枪鱼成分、鳕鱼成分、虹鳟鱼成分检测的PCR—试纸条方法。本文件适用于蓝鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大眼金枪鱼、太平洋鳕鱼、大西洋鳕鱼、黑线鳕鱼、狭鳕、虹鳟及其制品中金枪鱼成分、鳕鱼成分、虹鳟鱼成分的PCR—试纸条定性检测。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T35918Sanger属于鲈形目（Perciformes，鲭科（Scombridae）注1鱼（Thunnusthynnus）、长鳍金枪鱼（Thunnusalalunga）、黄鳍金枪鱼（Thunnusalbacares）、大眼金枪鱼（Thunnus注2：本文件中金枪鱼成分即指金枪鱼特异性DNA鳕形目（Gadiformes）鱼类，主要指鳕科（Gadidae）和无须鳕科（Merlucclidae）的鱼类注：本文件中鳕鱼成分即指鳕鱼特异性DNAOncorhynchus注：本文件中虹鳟鱼成分即指虹鳟鱼特异性DNA1CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid。dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate。EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid。FITC：异硫氰酸盐（Fluorescein5-isothiocyanate。Tris：三羟甲基氨基甲烷［Tris（Hydroxymethyl）aminomethane利用裂解液破碎样本细胞，苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，以提取的DNA为模板，采用上游和下游引物分别经异硫氰酸盐和生物素标记进行PCR扩增，获得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的PCR产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对PCR产物进行筛选检测，并对PCR阳性产物进行测序确证。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。检测用引物（对）检测用引物（对）序列及标记物详见表11引物（对）引物序列（55F：5’—TGGTATCAGGCACACCCAA-R：5’—CGCCGGTGTCTGTCAACTT-F：5’—TCTAGGCCTTTGCTTAATTACT-R：5’—CCTACGAAAGAGGTTATTATTACT-F：5’—GTCCCACTGTGGCTTGCT-R：5’—GGGTTCCTTCAGGCAATAA-ExTaqHotStartDNAdNTPs：dATP（脱氧腺苷三磷酸、dTTP（脱氧胸苷三磷酸、dCTP（脱氧胞苷三磷酸、三氯甲烷（氯仿2CTAB4.0gCTAB，16.364gNaCl，加20mL1mol/LTris-HCl液，8500mmol/LNa2-EDTA70mL双蒸水溶解，再定容至200mL103.4kPa（121℃）20min。CTAB1.0gCTAB，0.467gNaCl70mL200mL，103.4kPa（121℃）20min。25：24：1三氯甲异戊醇溶液24：1三氯甲异戊醇溶液氯化钠溶液（1.2mol/L）：在200mL双蒸水中加入35.05g氯化钠（NaCl，溶解后再加双蒸水定容至500mL氢氧化钠溶液（1mol/L）160mL8g（NaOH，200mLTris-HCl（1mol/L：称取121.1gTris溶解于800mL双蒸水中，用HCL调pH至8.0，加双蒸水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。蛋白酶（670U/mL：称取0.10g酶活为33.5U/mg（Unit，酶学单位的蛋白酶K干粉，加入5mL双蒸水，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解，分装成小份贮存于-20℃。试纸条：含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条，可通过采购的原料试剂自行组装（见附录A）或采用等效的商品化试纸条。2µL1mol/LTris-HCl液，200µL10mg/mLBSA，2mLTween-20，10mL1molLNaOH溶液，定容至200mL，涡旋混合均匀；或采用等效的商品化产品。离心机（离心力≥12000g，4℃±1℃微量移液器（100µL~1000µL，20µL~200µL，2µL~20µL，0.5µL~10µLPCR仪恒温水浴锅，65℃±1℃pH计鲜活成鱼宜取肌肉组织。如需非致死性取样，剪取部分鱼鳍条或者刮去部分皮肤后取皮下一小块3mm3~5mm3的肌肉块即可。其他鱼类制品，例如罐头、寿司等，宜取肌肉组织部分，少有312加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通3样品DNA提100mg2mL1mLCTAB10μL20mg/mL蛋白酶K，65℃温育1h，期间不时振荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量CTAB提12000g10min，转移上清2mL戊醇（25：24：1）颠倒混匀，12000g10min戊醇（24112000g10min移上清至干净离心管中，加入等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h；加入0.8倍体积的异丙220℃冰箱中预冷的无水乙醇混匀，-20℃30min，12000g4℃10min，70，12000g4℃10，50μL双蒸水，室10min，混匀，-20℃保存。也可按照GB/T35918的方法提取，或使用等效DNA提取试剂盒提取模板DNADNA浓度和纯度的测定5µLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm280nm处的吸光A260A280。DNA的浓度按公式（1）计算：c=A×N× cDNA浓度，单位为微克每微升A260nmNA260/A2801.7~1.9PCRPCR扩PCR反应体系见表22PCR反应体2.00.80.80.2DNA模板（41.0dNTP（2.5mM2.013.2PCR反应条件见表3，PCR反应条件随不同的PCR仪略有改变。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用含目标成分的样品作阳性对照，用不4含目标成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA3PCR反应条5μLPCR产物点于核酸试纸条样品垫，再加入95μL展开液后进行检测，5mi后观察结果。a）空白对照：质控线变红，检测线未变红。b）阴性对照：质控线变红，检测线未变红。c）阳性对照：质控线变红，检测线变红。试纸条质控线变红色，且检测线变红色，PCR扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物进行测序确证（B。试纸条质控线变红色，检测线不变色，PCR扩增产物为阴性。PCR产物试纸条检测为可疑阳性，同时序列相似度最高且大于98%者，判为含有XXX（目标物种）成分，结果报告为检XXX（目标物种）成分。PCR产物试纸条检测为阴性，判为不含有XX（目标物种成分，结果报告为未检出XX（目标物种）成分。检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T274032008中附录D本文件所规定方法的最低检出限（LOD）为0.1%（质量分数5 （资料性抗FITCa）Anti-FITCantibodyb）多克隆抗体：Anti-Fluorescein试纸条结构见图A.11—吸水滤纸垫2—结合物垫，附有FITC抗体（兔源）3—侧向层析基质（硝酸纤维素膜4—检测带，附有链亲和素5—质控带，附有可结合兔源抗体的抗体6—衬底7—吸水垫图 试纸条结构检测用试纸条的吸水垫上含有金标记的抗异硫氰酸盐（FITC）的兔多克隆抗体，可与PCR产物一条链上的FAM标记分子结合，在检测线位置上固定有链亲和素，可与PCR产物另一条链PCR扩增产物在展开液的作用下，首先与金标记的羧基荧光素抗体结合，通过虹吸作用向上部移动，在经过固定有链亲和素的检测线位置时，因带有生物素标记而被链亲和素捕获在该位置上，显示棕红色，过量的产物继续向上移动至固定有羊抗兔抗体的质控线位置，因其带有抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体而被捕获在质控线上，从而显示出两条色带。非特异性扩增的PCR产物因无生物素或异硫氰酸盐标记的缘故，不能与金标记的异硫氰酸盐抗体结合，且被链亲和素捕获，从而不能在检测线位置显示颜色，而未参与反应的PCR引物因带有异6 （资料性金枪鱼成分的基因扩增靶标参考序列（gennbankTGGTATCAGGCACACCCAACKAAAGCCCATGACGCCTTGCTTAGCCACACCCTCAAGGGAACTCAGCAGTGATAAACCTTAAGCTATAAGTGAAAACTTGACTTAGTTAAAGCTAAGAGGGCCGGTA鳕鱼成分的基因扩增靶标参考序列（gennbankGACAT