食品中有害物质的检测

第十三章食品中有害物质的检测第一节概论第二节食品中有害物质常用的检测方法第三节食品中农药残留及其检测〔第四节食品中兽药残留及其检测〕第五节食品中霉菌毒素及其检测〔第六节食品中天然毒素及其检测〕〔第七节食品中源于包装材料的有害物质及其检测〕〔第八节食品加工过程中形成的有害物质及其检测〕〔第九节食品中其他有害物质及其检测〕重点有机氯、有机磷农药的理化性质。两种农药测定预处理方法。两种农药测定的主要方法。黄曲霉毒素的测定方法。第一节概论一、有害物质与有毒物质的概念在自然界中,当某物质或含有该物质的物料被按其原来的用途正常使用时,假设因该物质而导致人体生理机能、自然环境或生态平衡遭受破坏时,那么称该物质为有害物质。有毒物质:一般的定义为但凡以小剂量进入机体,通过化学或物理化学作用能够导致健康受损的物质。有毒物质是相对的剂量决定二、食品中有害物质的种类与来源食品中有害物质分三大类：①是生物性有害物质,如黄曲霉、口蹄疫致病菌等；②是化学性有害物质,如DDT、氯丙醇、河豚毒素、重金属等；③是物理性有害物质,如金属屑、石子、动物排泄物、放射性元素等。第二节食品中有害物质常用的检测方法薄层色谱法气相色谱法高效液相色谱法质谱法色—质联用酶联免疫吸附剂测定主要农药有机氯杀虫剂有机磷杀虫剂拟除虫菊杀虫剂氨基甲酸酯杀虫剂1.有机氯农药〔Organochlorinepesticides,OCPs〕主要有六六六粉(六氯环己烷)、DDT(二氯二苯三氯乙烷)毒性特点：难分解、半衰期10年以上，高残留；污染食品严重，脂溶性强，蓄积于脂肪和脂肪高的组织；中等毒性，致癌、致畸作用。性质：不溶于水，易溶于脂肪、丙酮、乙醇、石油醚、环己烷，对光、热、酸稳定，对碱不稳定。2.有机磷农药〔OPPs〕是含有C—P键或C—O—P、C—S—P、C—N—P键的有机化合物。应用广。〔1〕分类：高毒有机磷〔早期开展，现已被禁止使用〕如对硫磷〔1605〕、内吸磷〔1059〕、甲胺磷〔3911〕等；中等毒有机磷如乐果、杀螟松、倍硫磷等；低毒有机磷如敌百虫、马拉硫磷、双硫磷等。〔2〕特点化学性质不稳定，易分解，污染食品后残留时间短，在生物体不易蓄积。在加工处理过程〔碾磨、洗涤、去皮、烹调〕中可减少。以急性毒性为主，表现出神经中毒病症。长时间接触对肝脏功能有损。过量或施用时期不当或使用高毒农药是造成有机磷农药污染食品的主要原因3.氨基甲酸酯类是一种高效、低毒、低残留的农药。通式：常见的有：甲萘威、呋喃丹、速灭威等。甲萘威4.拟除虫菊酯类是模拟天然除虫菊酯化学结构而合成的农药。常用的有氯菊酯、溴菊酯、氯氰菊酯、甲醚菊酯。

特点：高效、低毒、低残留，在环境中的降解以光解为主；对胆碱酯酶无抑制作用；亲脂性强，可溶于多种有机溶剂，在水中的溶解度小,在酸性条件下稳定，在碱性条件下易分解。食品中农药残留分析检测技术1.薄层色谱法〔TLC〕2.气相色谱法〔GC〕占70%3.气相色谱-质谱法〔GC-MS〕4.液相色谱法〔HPLC〕5.液相色谱-质谱法〔LC-MS〕6.超临界流体色谱〔SFC〕7.毛细管电泳〔CE〕8.免疫分析〔IA〕化学法、比色、分光光度法缺少特异性，灵敏度低纸色谱、薄层色谱法GC、HPLCGC-MS、LC-MS定性定量、多残留检测食品中有机氯农药残留量测定GB/T5009.19①GC-ECD法配标准混合使用液样品提取〔用丙酮、己烷、乙醚、石油醚等〕与净化〔用H2SO4磺化〕、浓缩〔K—D减压浓缩〕、GC检测、ECD检测器。色谱柱用硬质玻璃柱，假设用不锈钢柱，易引起农药分解。采样液体样品时，应用玻璃瓶，不能用塑料瓶。检测器的温度不应低于250℃，否那么，检测器很难平衡。注意尾吹气流量及分流比。②TLC法

食品中农药残留提取方法索式提取法超声波提取法高速均质提取法固相微萃取和超临界流体萃取技术

提取液净化方法液-液分配法吸附柱层析法固相萃取净化法凝胶色谱净化法

气相色谱法测定食品中有机氯农药残留量农药标准溶液：分别准确称取α-666、β－666、γ－666、δ－666、p，p’-DDT、p,p’-DDD、p,p’-DDE、o,p’-DDT、七氯、艾氏剂、狄氏剂、五氯硝基苯等农药标准品适量,用苯配成100μg/mL的贮备液存于冰箱中备用。临用时，根据各农药在仪器上的响应灵敏度,用石油醚将贮备液稀释成一定不同浓度的标准使用液，如六六六建议标准使用液浓度为20μg/mL,滴滴涕为0.01μg/mL,再用石油醚为稀释液配成标准混合使用液。实验步骤〔一〕样品的处理1．植物性样品的提取与净化〔1〕粮食：称取粉碎的、过20目筛的粮食试样10g，置于100mL具塞三角瓶中，参加20mL石油醚，于振荡器上振摇提取30min。〔2〕蔬菜：取适量蔬菜擦净,去掉不可食局部后称取蔬菜试样20g，切细,置于研钵中,加适量石英沙,充分研细,研匀，用30mL丙酮和30mL石油醚洗入烧杯中,经抽滤，滤液移入250mL分液漏斗中，参加100mL20g/L硫酸钠水溶液，充分摇匀，静置分层，将下层溶液转移到另一250mL分液漏斗中，用40mL石油醚分2次萃取，合并3次萃取的石油醚层，过15g无水硫酸钠，于旋转蒸发仪上减压浓缩至10mL。〔3〕层析柱的制备：玻璃层析柱中先参加1cm高无水硫酸钠，再参加5g5％水脱活弗罗里硅土，最后参加1cm高无水硫酸钠，轻轻敲实，用20mL石油醚淋洗净化柱，弃去淋洗液，柱面要留有少量液体。〔4〕净化与浓缩：准确吸取试样提取液2mL，参加已淋洗过的净化柱中，用100mL石油醚＋乙酸乙酯〔95＋5〕洗脱，收集洗脱液于蒸馏瓶中，于旋转蒸发仪上浓缩近干，用少量石油醚屡次溶解残渣于刻度离心管中，最终定容至1.0mL，供气相色谱分析。2．动物性样品的提取与净化(1)肉类去筋后,切成小块,制成肉糜,称取20g(精确到0.01g)于研钵中,加无水硫酸钠80g,研成细粉,移入具塞三角瓶中,加环己烷100mL，振摇30min,过滤,收集滤液于另一分液漏斗中加浓硫酸10mL磺化,振摇、放气、静置分层，弃磺化层。有机相屡次加浓硫酸5mL，反复磺化，直到无色透明，弃磺化层。有机相加2%硫酸钠溶液100mL，振摇、放气、静置分层，弃水层。有机相过15g无水硫酸钠脱水于K-D浓缩器中，浓缩至约，定容至1mL。浓缩样液可直接用于GC仪检测。同时做空白实验。〔2〕蛋类：蛋类去壳，制成匀浆，称取蛋类试样10g〔精确到0.01g〕，于具塞三角瓶中，加丙酮50mL，振摇30min,过滤于K-D浓缩器中，浓缩除去丙酮，向残渣加环己烷50mL溶解，移入分液漏斗中,振摇、静置分层，分出有机相，再用20mL环己烷分两次萃取，合并有机相，经15g无水硫酸钠脱水于分液漏斗中，用环己烷补足至100mL，加浓硫酸10mL磺化，以下操作同肉类样品处理。浓缩样液可直接用于GC仪检测。同时做空白实验。〔3〕乳类：取50g鲜乳样或与此相当乳制品于分液漏斗中，加乙醇50mL，草酸钾0.5g,振摇1min,加乙醚50mL,摇匀,加环己烷50mL,振摇2min,静置分层，弃下层,有机相经15g无水硫酸钠脱水,置K-D浓缩器中，浓缩，残液为黄色透明油状物，加环己烷50mL溶解，移入分液漏斗中,用环己烷补足至100mL，加浓硫酸10mL磺化，以下操作同肉类样品处理。浓缩样液可直接用于GC仪检测。同时做空白实验。3．测定〔1〕粮食、蔬菜气相色谱条件①色谱柱：石英弹性毛细管柱，0.25mm〔内径〕×15m，内涂有OV－101固定液。②温度：柱温自180℃升至230℃保持30min；检测器、进样口温度250℃。③气体流速：氮气：40mL/min，尾吹气：60mL/min，分流比1﹕50。〔2〕蛋类、肉类和乳类气相色谱条件①色谱柱：石英弹性毛细管柱，0.32mm〔内径〕×30m，内涂有OV－101固定液0.25μm。②温度：柱温自60℃以40℃/min的速度升温至170℃，再以2℃/min的速度升温5℃，再以40℃/min的速度升温至280℃，保持10min；检测器温度300℃；进样口温度270℃。③气体流速：氮气：1mL/min；尾吹：50mL/min。4．色谱分析吸取1μL试样液注入气相色谱仪，记录色谱峰的保存时间和峰高。再吸取1μL混标溶液进样，记录色谱峰的保存时间和峰高。根据组分在色谱上的出峰时间与标准组分比较定性：用外标法与标准组分比较定量。五、本卷须知1．本法检测灵敏度高，在分析时应注意防止由于色谱柱中高沸点固定液、样品净化不完全及载气不纯等带来的污染，使其灵敏度下降。2．色谱柱要用硬质玻璃柱，假设采用不锈钢柱，金属易引起农药分解。3．分析液体样品中有机氯农药采样时，应用玻璃瓶，不能用塑料瓶，因塑料瓶对有机氯农药测定有严重影响。4．电子捕获检测器有放射源，故检测器的出口一定要接到室外，且每6个月应测试一次有无放射形泄漏。5．电子捕获检测器的操作温度一般为250-300℃，无论柱温多么低，检测器的温度均不应低于250℃，否那么，检测器很难平衡。食品中有机磷农药残留量的测定

GB/T5009.20-2003原理：果蔬中有机磷残留提取有机溶剂净化气化注入GC

浓缩色谱柱中别离FPD检测记录色谱峰比较样品和标准品的色谱峰外标定量〔多用峰高〕仪器与试剂〔一〕仪器1．气相色谱仪：附有火焰光度检测器〔FPD〕2．电动振荡器3．组织捣碎机4．旋转蒸发仪〔二〕试剂1．二氯甲烷2．无水硫酸钠：在700℃灼烧4h后备用。3．中性氧化铝：300℃活化4h。4．有机磷农药标准贮备液：分别准确称取有机磷农药标准品敌敌畏、乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲拌磷、稻瘟净、倍硫磷、杀螟硫磷及虫螨磷各10.0mg，用苯〔或三氯甲烷〕溶解并稀释至100mL，放在冰箱中保存。5．有机磷农药标准使用液：临用时用二氯甲烷稀释为使用液，使其浓度为敌敌畏、乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲拌磷每毫升各相当于1.0μg，稻瘟净、倍硫磷、杀螟硫磷及虫螨磷每毫升各相当于2.0μg。果蔬搅碎足量的无水硫酸钠30~100g取样10g振摇0.5h脱色70ml二氯甲烷脱水定容至2ml过滤35ml滤液室温通风挥至近干移入5ml具塞刻度试管0.2~0.8g活性炭二氯甲烷多次研洗残渣样品处理不同种类样品，处理方法有所不同。实验步骤〔一〕样品处理1．蔬菜：取适量蔬菜擦净,去掉不可食局部后称取蔬菜试样，将蔬菜切碎混匀。称取10.0g混匀的试样，置于250mL具塞锥形瓶中，加30g～100g无水硫酸钠脱水〔根据蔬菜含水量〕，剧烈振摇后如有固体硫酸钠存在，说明所加无水硫酸钠已够。加0.2g～0.8g活性炭脱色〔根据蔬菜色素含量〕。加70mL二氯甲烷，在振荡器上振摇0.5h，经滤纸过滤。量取35mL滤液，在通风柜中室温下自然挥发至近干，用二氯甲烷少量屡次研洗残渣，移入10mL具塞刻度试管中，并定容至2mL，备用。2．谷物：脱壳、磨粉、过20目筛、混匀。称取10g置于具塞锥形瓶中，参加0.5g中性氧化铝〔脱油〕〔小麦、玉米再加0.2g活性炭〕及20mL二氯甲烷，振摇0.5h，过滤，滤液直接进样。假设农药残留过低，那么加30mL二氯甲烷，振摇过滤，量取15mL滤液浓缩，并定容至2mL进样。〔二〕色谱条件1．色谱柱：玻璃柱，内径3mm，长1.5m～2.0m。担体：60目～80目美国ChromosorbWAWDMCS〔酸洗二甲基二氯硅烷化白色担体〕〔1〕别离测定敌敌畏、乐果、马拉硫磷和对硫磷的色谱柱①2.5％SE－30〔甲基硅橡胶，极弱极性〕和3％QF－1〔三氟丙基甲基聚硅氧烷，中等极性〕混合固定液②1.5％OV－17和2％QF－1混合固定液〔2〕别离测定甲拌磷、稻瘟净、倍硫磷、杀螟硫磷及虫螨磷的色谱柱①3％PEGA〔聚乙二醇己二酸酯，较强极性〕和5％QF－1混合固定液②2％NPGA〔己二酸新戊二醇聚酯，中等极性〕和3％QF－1混合固定液2．气流速度：载气为氮气80mL/min；空气50mL/min；氢气180mL/min〔根据仪器选择各自的最正确比例条件〕。3．温度：进样口220℃；检测器240℃；柱温180℃，但测定敌敌畏〔其稳定性差〕为130℃。〔三〕测定将有机磷农药标准使用液2μL～5μL分别注入气相色谱仪中，可测得不同浓度有机磷标准溶液的峰高，分别绘制有机磷农药标准曲线。同时取试样溶液2μL～5μL注入气相色谱仪中，测得峰高，从标准曲线图中查出相应的含量。二氯甲烷作提取剂毒性较小较便宜说明：国际上多用乙腈作为有机磷农药的提取剂及分配净化试剂，但其毒性较大，且较贵。蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测GB/T5009.199-2003方法一速测卡法〔纸片法〕实验原理：胆碱脂酶可催化靛酚乙酸脂〔红色〕水解为乙酸与靛酚〔蓝色〕，有机磷或氨基甲酸脂类农药对胆碱脂酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸脂类农药的存在。实验试剂：1、固化有胆碱脂酶和靛酚乙酸脂试纸卡片〔速测卡〕；2、pH7.5磷酸盐缓冲液：分别称取15.0g磷酸氢二钠[Na2HPO4•12H2O]与1.59g无水磷酸二氢钾[KH2PO4]，用500mL蒸馏水溶解。实验步骤：1、整体测定法〔1〕选取具有代表性的蔬菜样品，擦去外表泥土，剪成1cm左右方形碎片,取5g放入带盖瓶中，参加10mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上.(2)取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反响，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反响后的药片外表必须保持湿润。〔3〕将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反响。注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。2、外表测定法〔粗筛法〕〔1〕擦去蔬菜外表泥土，滴2～3滴缓冲液在蔬菜外表，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。〔2〕取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。〔3〕放置10min以上进行预反响，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反响10min，预反响后的药片外表必须保持湿润。〔4〕将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反响。注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。结果判断：结果以酶被有机磷或氨基甲酸脂类农药抑制〔为阳性〕、未抑制〔阴性〕表示。与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定具体农药品种和含量。本卷须知及说明：1、速测卡灵敏度指标如下表所示。局部农药检出限参考表农药名称检出限（mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）甲胺磷1.7乙酰甲胺磷3.5久效磷2.5对硫磷1.7敌敌畏0.3甲萘威2.5水胺硫磷3.1敌百虫0.3好年冬1.0马拉硫磷2.0乐果1.3呋喃丹0.5氧化乐果2.32、速测卡符合率：在检出的30份以上阳性样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。3、葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株〔体〕蔬菜浸提或采用外表测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株〔体〕蔬菜浸提法，减少色素的干扰。4、当温度条件低于37℃，酶反响速度随之放慢，药片加液后放置反响的时间也应相对延长，延长时间确实定，应以空白对照卡用手指〔体温〕捏3min时可以变蓝，即可往下操作。注意样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。空白对照卡不变色的原因：一是药片外表缓冲溶液加得少、预反响后的药片外表不够湿润；二是温度太低。5、红色药片与白色药片叠合反响的时间以3min为准，3min后的蓝色会逐渐加深，24h后颜色会逐渐退去。方法二酶抑制率法〔分光光度法〕实验原理：根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中参加生化反响底物碘化硫代乙酰胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就不被抑制，参加的底物就能被酶水解，水解产物与参加的显色剂反响产生黄色物质。如果蔬菜的提取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底物就不被水解，当参加显色剂时就不显色或颜色变化很小。用分光光度计在412nm处或农药残毒快速检测仪测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，就可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况。试剂：1、pH8.0缓冲液11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，溶解于1000mL蒸馏水中。2、乙酰胆碱酯酶根据酶活力用缓冲溶液溶解，3min的吸光值变化ΔA0值应控制在0.3以上。摇匀后在4℃冰箱中保存，保存期不超过4天。3、底物25.0mg碘化硫代乙酰胆碱，用3.0mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱保存。保存期不超过2周。4、显色剂160mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱保存。5、可选用由以上试剂制备的试剂盒。乙酰胆碱酯酶的ΔA0值应控制在0.3以上。分析步骤：1、样品处理选取有代表性的蔬菜样品，去掉不可食局部，冲洗掉外表泥土，剪成1cm左右见方碎片。取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，参加5mL缓冲液，振荡1～2min，倒出提取液，静置3～5min，待用。2、对照溶液测试先于试管中参加2.5mL缓冲液，再参加0.1mL酶液、0.1mL显色剂。摇匀后于37℃放置15min以上〔每批样品的控制时间应一致〕。参加0.1mL底物摇匀，此时检液开始显色反响，应立即放入比色皿中，记录反响3min的吸光度的变化值ΔA0。3、样品溶液测试先于试管中参加2.5mL样品提取液，其他操作与对照测定相同，记录反响3min的吸光度的变化值ΔAt。结果计算：

结果判断：当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示样品中有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药残留，可判定样品为阳性结果，对检验结果阳性的样品需重复检验两次以上。本卷须知及说明1、对检验结果阳性的样品，需用其他方法进一步确定残留农药的种类和进行定量测定。2、酶抑制率法对局部农药的检出限为：农药名称检出限（mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）敌敌畏0.1氧化乐果0.8对硫磷1.0甲基异柳磷5.0辛硫磷0.3灭多威0.1甲胺磷2.0丁硫克百威0.05马拉硫磷4.0敌百虫0.2乐果3.0呋喃丹0.053、葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性，处理样品时，可采取整株〔体〕蔬菜浸提或采用外表测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株〔体〕蔬菜浸提法，减少色素的干扰。4、当温度条件低于37℃，酶反响速度随之放慢，药片加液后放置反响的时间也应相对延长，延长时间确实定，应以胆碱酯酶空白对照测试的吸光度变化ΔA0在0.3以上为准。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。酶的活性不够和温度太低都可能造成胆碱酯酶空白对照液3min的吸光度ΔA0变化值＜0.3。5、该法适用于大量蔬菜样本的筛检，不适用于最后的仲裁检测。食品中黄曲霉毒素B1的测定GB/T5009.22—2003

黄曲霉毒素〔AFT〕是一组化学结构类似的化合物，根据其在365nm紫外光下呈现的荧光颜色可分为B、G两大类。根据Rf值不同，又分为B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中以AFTB1毒性、致癌性最强，且含量多。常以B1为主要指标。黄曲霉毒素的根本结构为二呋喃环和香豆素。AFT主要污染：花生、花生油、玉米、大米、乳制品、腌制鱼肉等，M1和M2主要存在于牛奶中。性质：难溶于水，不溶于乙醚、石油醚及己烷。易溶于油、甲醇、丙酮、氯仿、苯及乙腈等有机溶剂。对光、热、酸较稳定，对碱和氧化剂那么不稳定。其纯品为无色结晶，紫外线对低浓度AFT有破坏性。食品中AFTB1的允许量标准玉米、花生、花生油为≤20μg/Kg玉米及花生制品〔按原料折算〕为≤20μg/Kg大米、其他食用油为≤10μg/Kg其他粮食、豆类、发酵食品、发酵酒、糕点、饼干、面包等为≤5μg/Kg婴儿食品不得检出。3学时薄层层析法原理样品中黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、浓缩、薄层别离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素B1的含量。薄层色谱法黄曲霉毒素B1的最低检出量为0.0004μg，检出限为5μg／Kg。。仪器和试剂(1)仪器小型粉碎机、样筛、电动振荡器、玻璃浓缩器、玻璃板5cm×20cm、薄层板涂布器、展开槽(内25cm×6cm×4cm)、紫外光灯100一125w带波长365nm滤光片、微量注射器(2)试剂①三氯甲烷、正己烷或石油醚(沸程30～60℃或60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。以上试剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可使用，否那么需逐一进行重蒸。②硅胶G(薄层色谱用)、三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠、苯一乙腈(98+2)混合液、甲醇水溶液(55+45)。③黄曲霉毒素B1标准液：准确称取1～1.2mgAFTB1标准品，先参加2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4℃保存。此标准液浓度约为10ug／mL。先用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯一乙腈混合液调整其浓度恰为10.0ug／mL。在350nm，AFTB1在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19800。④黄曲霉毒素B1标准使用液：I液(1.0ug／mL)：取1mLAFTB1标准液(10.0ug／mL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI，按上法定容5mI。⑤次氯酸钠溶液(消毒用)：取100g漂白粉，参加500mL水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·10H2O)溶于500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸约25g／L。污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可到达去毒的效果。分析步骤一、样品处理取大样，经粗碎及连续屡次用四分法缩减至0.5～lkg后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛，混匀。二、提取称取20.00g经粉碎样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水溶液，瓶塞上涂一层水、盖严防漏。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00mL甲醇水溶液(相当于4.0g样品)置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜，于65℃水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却2～3min后，准确参加1mL苯一乙腈混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，假设有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2mL的具塞试管中。三、测定①单向展开法a．薄板制备：称取3g硅胶G，加2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊状后，倒入涂布器推成5cm×20cm，厚度约0.25mm的薄层板3块。在空气中枯燥15min，在100℃活化2h，取出，放枯燥器中保存。b．点样：在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距为lcm，点直径约3mm，在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下：

第一点：10μLAFTB1标准使用液(0.04μg／mL)。

第二点：20μL样液。

第三点：20μL样液+10μL0.04μg／mLAFTBl标液。

第四点：20μL样液+10μL0.2μg／mLAFTB1标液。

c．展开与观察：在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展开10～12cm，取出，在紫外光下观察结果，方法如下：第一点应有荧光，第一点滴加了AFTB10.4ng，作为最低检出量。如无荧光，那么可能是薄层板未制好或色谱条件有问题。第一点有荧光，而其余三点无荧光，说明样液中有荧光猝灭剂，样液需重新制备。第一点有荧光，第二点无荧光，三、四点有荧光。说明样液不含AFTB1或含量小于最低检出量〔<5μg／kg〕。四个点都有荧光。需做确证实验后再进行定量。由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标准点与样液中AFTB1荧光点重叠。假设样液为阴性，薄板上第三点AFTB1为0.4ng，可用作检查样液中AFTB1最低检出量是否正常出现；假设样液为阳性，那么起定性作用。薄层板上第四点AFTB1标准为2ng，主要起定位作用，在上述色谱条件下，AFTB1的Rf值约在0.6左右。d．确证试验:第一点：10μL0.04μg／mLAFTBl标准使用液。第二点：20μL样液于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反响5min后，用吹风机吹热风2min(板上温度不高于40℃)，再于薄层板上滴加以下两点。第三点：10μL0.04μg／mLAFTBl标准使用液。第四点：20μL样液。按上法展开并观察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。e．稀释定量：假设样液中荧光强度比最低检出量强，那么根据其强度估计，减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下：第一点：l0μLAFTB1标准使用液(0.04μg／mL)。第二点：根据情况滴加10μL样液。第三点：根据情况滴加15μL样液。第四点：根据情况滴加20μL样液。f．结果计算：

式中：X一样品中AFTBl的含量，ug／kg；V1一参加苯一乙腈混合液的体积，mL；V2—出现最低荧光时滴加样液的体积，mL；D一样液的总稀释倍数；m1—参加苯一乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g；0.0004—AFTBl的最低检出限量，ug。②双向展开法〔滴加两点法〕(1)点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加AFTB1标液与样液。即在距左边缘0.8～1cm处各滴加10uLAFTB1(0.04ug／mL)标准液，在距左边缘2.8～3cm处各滴加20uL样液。然后在第二块板的样液点上加滴l0uLAFTBl(0.04ug／mL)标准液，在第三块板的样液点上加滴10uLAFTB1(0.2ug／mL)标准液。(2)展开：a．横向展开：10mL无水乙醚，展至板端后，取出挥干。根据情况，可再重复l～2次。b．纵向展开：以丙酮一三氯甲烷(8+92)展开至10～12cm为止。(3)观察与评定结果：a．在紫外灯下观察第一、二块板，假设第二块板的第二点在AFTB1标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光，那么样品中AFTBl含量<5ug／kg.b．假设第一块板在与第二块板的相同位置上出现荧光点，那么将第一块板与第三块板比较，看第三块板上第二点与第一块板上第二点的相同位置上的荧光点是否与AFTB1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，三块板可以同时做，也可按顺序做。当第一块板出现阴性时，第三块板可以省略，如第一块板为阳性，那么第二块板可省略，直接做第三块。

(4)确认试验：另取薄层板二块，于第四、五两板距左边缘0.8～1cm处，各滴加10uLATTB1(0.04ug／mL)标准液及一小滴三氟乙酸；在距左边缘2.8～3cm处，于第四板滴加20uL样液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20uL样液、10uLAFTBl(0.04ug／mL)标准液及一小滴三氟乙酸，反响5min后，用热风吹2min(板上温度不高于40℃)。再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与AFTB1标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。假设样液AFTB1含量较高时，那么将样液稀释后，按单向展开法中d做确认试验。(5)稀释定量：(6)结果计算：同单向展开法。说明及本卷须知用过后受污染的玻璃器皿，应经次氯酸溶液(25g／L)，浸泡消毒数小时后再清洗之！酶联免疫(ELISA)法实验原理：

采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反响，多余的游离抗体那么与酶标板内的包被抗原结合，参加酶标记物和底物后显色，与标准比较测定含量。仪器与试剂：〔一〕试剂盒组成1、AFB1抗原包被16孔×6条形带框酶标板；2、抗体；3、酶标二抗；4、空白对照液；5、底物〔1mg×4〕；6、底物液A；7、底物液B；8、终止液(2mol/LH2SO4)；9、PBS一T洗液；10、一次性手套〔2副〕。〔二〕仪器1、酶标仪；2、离心机。实验步骤：〔一〕样品中AFB1的提取1．大米和小麦〔脂肪含量＜3.0％〕样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，参加250mL具塞锥形瓶中。准确参加60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中，立即取12mL滤液〔相当4.0g样品〕于75mL蒸发皿中。65℃水浴通风挥干。用2.0mL甲醇一PBS(20+80)分三次〔0.8mL、0.7mL、0.5mL〕溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。2.玉米〔脂肪含量3.0～5.0％〕样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，参加250mL具塞锥形瓶中。准确参加50.0mL甲醇一水〔80+20〕溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中,待分层后，放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯内，从中取10.0mL〔相当于4.0g样品〕于75mL蒸发皿中,以下按上述“65℃水浴通风挥干〞起，依法操作。3．花生〔脂肪含量15.0－45.0％〕样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，参加250mL具塞三角瓶中，准确参加100.0mL甲醇-水(55＋45〕溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇-水溶液于100mL烧杯内，从中取20.0mL〔相当于4.0g样品〕置于另一125mL分液漏斗中，参加20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层〔如有乳化现象可滴加甲醇促使分层〕．放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一并于蒸发皿中，以下按上述“65℃水浴通风挥干〞起，依法操作。4．植物油用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL甲醇-水(55＋45〕溶液分次洗烧杯，溶液一并移入分液漏斗中。〔精炼油4.0g样为4.525mL，可直接用移液器参加分液漏斗再加溶剂后振摇〕振摇2min，静置分层后，放出下层甲醇-水溶液于75mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇-水溶液重复振摇提取一次，提取液一并参加蒸发皿中，以下按自“65℃水浴通风挥干〞起，依法操作。5．其它食品：可按照前面方法有关章节操作，最终提取物〔相当于4.0g样品〕应收集于2.0mL甲醇一PBS(20＋80)中。〔二〕样品测定1、将以下试剂稀释后备用PBS一T洗液：390mL蒸馏水稀释〔1:40〕；底物液A:9mL蒸馏水稀释〔1:9〕；抗体:7.0mL洗液稀释〔1:140〕；酶标二抗:10mL洗液稀释〔1:200〕；阴性对照液:200μl抗体十200μl空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置。2、抗体抗原反响将抗体与等量样品提取液在玻璃试管内混合振荡后室温静置15分钟。启封酶标板，用洗液2×3分钟洗板后在吸水纸上拍干，分别在适当孔位参加此抗体抗原反响液及空白对照液〔3孔〕和阴性对照液〔3孔〕,130μl／孔,37℃湿盒中孵育〔或加盖以保持相对湿度〕，2小时后，倒掉反响液并拍干,用洗液3×3分钟洗板，拍干。3、酶标记反响参加酶标二抗，100μl／孔，37℃盒中孵育1小时后，用洗液5×3分钟洗板，拍干。4、显色反响lmg底物+2.5m1底物液A＋42μl底物液B，待底物充分溶解后参加酶标板，100μl／孔，37℃15分钟后加终止液40μl／孔。5、测定酶标仪490nm测定各孔OD值。数据处理及计算结果：lgCOD%标准竞争抑制曲线薄层层析法(GB1法)和液相色谱法：可定性、定量，应用广，检测周期长,程序复杂,所需试剂繁多。免疫化学分析方法〔如酶联免疫法(GB2法)、胶体金免疫层析试纸法〕：快速,简便,特异,敏感,低耗，不需贵重仪器。适合大量样品的筛检及现场检测。受环境影响，可能会出现假阳假阴。常见的动物性天然有害物质1.动物肝脏中的毒素〔胆酸〕2.河豚毒素3.岩蛤毒素4.螺类毒素5.组胺常见的植物性天然毒素1.氰苷2.红细胞凝集素3.龙葵碱4.秋水仙碱5.棉酚6.毒蘑菇第九节食品中其他有害物质及其检测天然有害物质食品中苯并(a)芘食品中苯并(a)芘的测定方法：GB/T5009.27-2003①荧光分光光度法试样经提取〔如环己烷〕、或经皂化后提取，净化后于乙酰化滤纸上层析别离苯并(a)芘，在波长365nm的紫外灯下观察〔蓝紫色荧光〕斑点，剪下，用苯浸出，测定荧光强度。②目测比色法同上，直接在滤纸上与标准斑点进行目测比色概略定量。苯并(a)芘〔多环芳烃〕是烟熏食品、煎炸食品和焙烤食品中主要的毒素和致癌物。乙酰化：引入乙酰基CH3CO-，常用乙酸酐做乙酰化试剂。盐酸克伦特罗的测定

动物性食品中克伦特罗残留量的测定：GB/T5009.192-2003①GC-MS②HPLC③ELISA

原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法GB/T22388-2008①HPLC

试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。②LC-MS③GC-MS食品中重金属污染及其检测主要指：Hg、Cd、Pb、As来源：水源、土壤、环境、原料、辅料、添加剂、农药、化肥的使用、加工、制造、运输、容器等带入。食物链——水鱼鸭子人农作物食品饲料家畜肉制品积蓄性食物链的生物富集作用食品中重金属元素的限量标准见表13－9。P273食品中重金属元素的主要检测方法：原子吸收分光光度法：选择性好、灵敏度高、简便、快速。溶剂萃取比色法：设备简单、价廉、灵敏度可满足要求。原子荧光光度法

离子选择电极法测定食品中限量元素的一般过程：金属螯合物的溶剂萃取法用适宜的金属螯合剂在一定条件下与被测金属离子生成金属螯合物，然后用有机溶剂进行液液萃取，使金属螯合物进入有机相从而到达别离与浓缩。金属螯合物溶于有机溶剂，如果有色可进行比色测定。此法为萃取比色法。优点：较高的灵敏度，选择性，别离效果好，设备简单，操作快速。缺点：工作量较大，耗用试剂，溶剂较贵，有的易挥发，易燃，有毒等。环状结构的络合物〔一〕螯合反响与亲水性金属离子在未成螯合物之前，受水分子极性作用，以水合离子形式存在，为亲水性，难溶于有机溶剂，故不好直接用有机溶剂萃取。选择适当的金属螯合剂可将金属离子变为疏水性的金属螯合物，然后再萃取。〔取代水分子，中和电荷〕物质能否有亲水性，主要看其是否能与水分子形成氢键。H—O—H┄O由于“O〞电负性强〔吸电子云能力〕，H与O的电子对被强烈吸到“O〞一边，H外边几乎没有电子云，与另一分子中“O〞〔带负电〕产生了静电吸引，即氢键。电负性O＞N＞S、Cl物质的亲水性规律但凡离子都有亲水性；含亲水基团越多，其亲水性越强。如—OH，—SO3H，—NH2含疏水基团越多，相对分子质量越大，其疏水性越强。如烷基、芳香基。〔二〕萃取别离的根本原理

1.分配系数PD

萃取时，有两相互不相溶，一相为水相，一相为有机相，物质A在两相中存在量不同。在一定温度下，分配到达平衡。A在两相中活度比不再变，即PD为常数。PD=αA，有/αA，水 浓度很低时，用浓度代替活度αPD=[A]有/[A]水2.分配比D=C有/C水C有——溶质在有机相中各种存在形式的总浓度 C水——溶质在水相中各种存在形式的总浓度3.萃取百分率E表示萃取的完全程度E=〔被萃取物在有机相中的总量/被萃取物的总量〕×100%E=C有·V有/〔C水·V水+C有·V有〕上下同除以C水，=〔C有/C水〕V有/〔V水+C有/C水×V有〕因为C有/C水=D=D·V有/〔V水+D·V有〕

E=D/〔V水/V有+D〕×100%假设D＝1，那么萃取一次的萃取百分率为50％〔当用等体积溶剂进行萃取时〕。假设要求一次萃取百分率大于90％，那么D必须大于9。当D不高时，一次萃取不能满足别离的要求，此时可采用屡次萃取的方法来提高萃取率。〔三〕萃取平衡与条件1、常用的螯合剂食品分析中常用的：双硫腙〔HDZ〕二乙基二硫代氨基甲酸钠〔NaDDTC〕丁二酮肟铜铁试剂这些螯合剂与金属离子生成金属螯合物，相当稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，许多带有颜色可直接比色。2、金属螯合物的萃取平衡用有机溶剂萃取金属螯合物，金属在有机相和水相中的分配比与许多因素有关，当其他因素固定下来以后，金属分配比与pH有关。3、影响分配比值的几个因素〔1〕螯合剂的影响：螯合剂与金属离子生成的螯合物越稳定，萃取效率就越高。螯合剂含疏水基团越多，亲水基团越少，萃取效率就越高。EDTA就不行〔2〕pH的影响：pH越高，有利于萃取，但金属离子可能发生水解反响。∴要正确控制溶液的酸度，对萃取有利，还可提高螯合剂对金属离子的选择性。例：Zn2+的最适宜pH为6.5—10pH太低：难于生成螯合物pH太高：形成Zn022-(3)萃取溶剂的选择：溶剂是否有利于萃取的别离主要取决于它们的物理性质和化学性质。①一般尽量采用惰性溶剂，防止产生副反响。②根据螯合物的结构，由相似相溶原理来选：含烷基螯合物选卤代烃〔CCl4、CHCl3等〕，含芳香基螯合物选芳香烃〔苯、甲苯等〕③溶剂的相对密度与水差异要大、粘度小。④无毒，无特殊气味，挥发性较小。4．干扰离子的消除一种螯合剂往往同时和几种金属离子形成螯合物，控制条件可有选择地只萃取一种离子或连续萃取几种离子，使之相互别离。⑴控制酸度控制溶液的pH值⑵使用掩蔽剂例：KCN可掩蔽Zn2+、Cu2+柠檬酸铵可掩蔽Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe3+EDTA可以掩蔽除Hg2+、Au3+以外许多金属离子。掩蔽剂的使用与溶液pH有关。在含Hg2+，Bi3+，Pb2+，Cd2+溶液中用二苯硫腙—CCl4萃取萃取Hg2+，假设控制溶液的pH等于1．那么Bi3+，Pb2+，Cd2+不被萃取要萃取Pb2+，可先将溶液的pH调至4—5，将Hg2+，Bi3+先除去，再将pH调至9—10，萃取出Pb2+铅的测定〔Pb〕铅污染的来源很多：工业“三废〞，使用含铅汽油的汽车尾气、农药，某些加铅作为稳定剂的塑料制品、搪瓷、陶瓷餐具的釉彩，含铅皮蛋，食品生产管道、设备、马口铁罐头，膨化食品，含铅化装品等。铅对人类神经和生殖系统有强烈的毒性，还会引起造血器官、肾脏等发生明显的病变。GB/T5009.12—2003《食品中铅的测定》1.石墨炉原子吸收光谱法首选方法283.3nm要进行背景校正，加基体改进剂。灯电流程序升温2.氢化物原子荧光光谱法3.火焰原子吸收光谱法试样经处理后，铅离子在一定pH条件下与DDTC形成络合物，经4一甲基戊酮-2萃取别离，直接测有机相。乙炔流量要减小。4.二硫腙比色法5.单扫描极谱法双硫腙法测定Pb原理样品经消化后，在pH8.5∽9.0时，双硫腙与Pb2+形成红色络合物，溶于CHCl3等有机溶剂中，颜色的深浅与Pb2+浓度成正比。参加盐酸羟胺、KCN、柠檬酸铵可防止Fe3+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+、Sn2+等干扰。与标准系列比较定量。试剂仪器注意点：①用去离子水或二次蒸馏水。②盐酸羟胺、柠檬酸铵试剂要除重金属Pb2+等。③金属离子标准液通常配较浓的贮备液，使用液要临用前稀释。④双硫腙使用液配成70%的透光率〔A=0.155，510nm，以CHCl3为参比〕，浓度大本身颜色深，影响测定。⑤所用的玻璃仪器要用10-20%HNO3浸泡过夜，再反复冲洗干净。双硫腙与重金属反响灵敏，被测物含量低。消化时本卷须知：①HNO3-H2SO4法中要先加HNO3将大局部“C〞分解完，后加H2SO4，或同时加，不要反加，防止炭化结快变黑，难以消化完全。②溶液一变棕色转深〔炭化〕，就立即加HNO3。③硝酸〔高氯酸〕一次不要参加过多。④开始时小火，防止样品