高级技能训练：分离技术实验

实验一:双水相萃取牛血清蛋白实验目的了解双水相系统的成相原理和方法；了解制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识；掌握双水相溶液配制与双水相萃取的操作；掌握分配系数和萃取收率的计算方法。实验原理双水相系统是由两种互不相溶的聚合物（如聚乙二醇（PEG）与葡聚糖（DX））或者互不相溶的聚合物溶液和盐溶液（如PEG与（NH）SO）组成。双水相系统的424制备一般是将两种溶质分别配制成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照不同的比例混合，静止一段时间，当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时，就会产生两相。相图是研究双水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1是典型的高聚物-高聚物双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B,下相主要含A。曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B,T、B量的多少服从相图的杠杆定律。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。双水相萃取与有机溶剂萃取原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配原则。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水性、氢键、离子键等）的存在，使得待分离的物质在上、下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化的目的。本实验选择PEG-硫酸铵双水相系统萃取牛血清蛋白。双缩脲反应是指蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子结合生成紫色络合物的反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应，蛋白质含有多个肽键，因此有双缩脲反应，反应生成物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以利用双缩脲反应进行蛋白质的定量测定。三、试剂及仪器仪器：紫外可见分光光度计，电子天平，台式高速离心机，电热恒温水浴箱，漩涡混合仪，滴定管，大试管，离心试管（20mL）6只,移液管（1mL,5mL）,试管（10mL）,注射器（10mL）试剂：PEG2000，硫酸铵，牛血清蛋白，双缩脲试剂四、实验内容1、 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定（1） 取50%的PEG2000溶液（w/v）10mL于大试管中；（2） 用40%的硫酸铵溶液（w/v）装入滴定管中向大试管滴加，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止，记录硫酸铵消耗的体积。加入1mL水使溶液澄清，继续用硫酸铵滴定至恰好混浊，重复7次，记录每次硫酸铵消耗的体积，计算每次出现混浊时体系中PEG和硫酸铵的浓度（w/v），并填入表1中。（3） 以硫酸铵的浓度（w/v）为横坐标，PEG的浓度（w/v）为纵坐标作图，即得到PEG2000-硫酸铵的相图。2、 利用PEG2000-硫酸铵双水相体系分离牛血清蛋白（1） 利用双水相体系分离牛血清蛋白根据相图，选择三个成相比例，分别加入3mL浓度为10mg/mL牛血清蛋白溶液。搅拌均匀，3500r/min离心5min，静置分层，分别量取记录上下相的体积。（2） 蛋白质浓度的测定标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清蛋白(BSA)配制成10mg/mL的标准蛋白溶液。标准曲线的测定：取六支试管分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,l.OmL的标准蛋白质溶液，并用水补足到1mL，然后加入4mL双缩脲试剂(ANaOH3.5mL,BCuSO40.5mL)，充分摇匀后在室温下放置30min,在540nm波长下测定吸光度。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照样。以蛋白质含量为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。样品的测定：按照标准曲线测定方法，分别取上下相溶液1mL置于两支试管中，分别加入4mL双缩脲试剂测定吸光度。与标准曲线对照，计算出牛血清蛋白的含量和萃取收率。表1PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的制作表编号累计加水量(mL)硫酸铵溶液读数大试管中纯硫酸铵的累计量(g)溶液的总体积(mL)PEG2000的浓度(w/v)硫酸铵的浓度(w/v)1021324354657687五、实验结果1、根据实验所得数据,计算系统的相比,蛋白在不同双水相系统中的分配系数及收率。计算公式如下：表观分配系数K=Ct/Cb相比R=Vt/Vb收率p=下相蛋白含量/上下相蛋白总含量二Vt*ct/(Vt*Ct+Vb*Cb)二R*K/(1+R*K)式中Ct、Cb分别为上下相蛋白浓度；Vt、Vb分别为上下相体积。比较上下相蛋白总含量与加入的蛋白总量是否一致。六、讨论1、 如何正确绘制相图？如何根据相图配制双水相体系，并对混合物进行分离？2、 实验操作中应注意哪些问题？分析实验误差。实验二大孔树脂吸附分离实验一、实验目的1、了解大孔树脂的使用方法；2、 掌握利用大孔树脂的静态和动态吸附分离操作；3、 掌握大孔树脂的洗脱方法；4、学习吸附等温曲线、吸附动力学曲线和洗脱曲线的测定方法。二、实验原理大孔树脂是一种具有大孔结构的有机高分子共聚体，是一类人工合成的有机高聚物吸附剂。因其具多孔性结构而具筛选性，又通过表面吸附、表面电性或形成氢键而具吸附性。一般为球形颗粒状，粒度多为20-60目。大孔树脂有非极性(HPD-100,HPD-300,D-101,X-5,H103)、弱极性(AB-8,DA-201,HPD-400)、极性(NKA-9,S-&HPD-500)之分。大孔吸附树脂理化性质稳定，一般不溶于酸碱及有机溶媒，在水和有机溶剂中可以吸收溶剂而膨胀。大孔树脂吸附技术以大孔吸附树脂为吸附剂，利用其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选用适宜的吸附和解吸条件借以分离、提纯某一或某一类有机化合物的技术。吸附分离依据相似相容的原则，一般非极性树脂宜于从极性溶剂中吸附非极性有机物质，相反强极性树脂宜于从非极性溶剂中吸附极性溶质，而中等极性吸附树脂，不但能从非水介质中吸附极性物质，也能从极性溶液中吸附非极性物质。大孔吸附树脂吸附技术广泛应用于制药及天然植物中活性成分如皂甙、黄酮、内脂、生物碱等大分子化合物的提取分离以及维生素和抗生素的提纯、化学制品的脱色、医院临床化验和中草药化学成分的研究等。它具有吸附快，解吸率高、吸附容量大、洗脱率高、树脂再生简便等优点。大孔树脂吸附分离操作步骤：（1）树脂的预处理目的是为了保证制剂最后用药安全。树脂中含有残留的未聚合单体，致孔剂，分散剂和防腐剂对人体有害。预处理的方法：乙醇浸泡24h-用乙醇洗至流出液与水1：5不浑浊一用水洗至无醇味一5%HCl通过树脂柱，浸泡2-4h~水洗至中性一2%NaOH通过树脂柱，浸泡2-4h~水洗至中性，备用。（2）上样将样品溶于少量水中，以一定的流速加到柱的上端进行吸附。上样液以澄清为好，上样前要配合一定的处理工作，如上样液的预先沉淀、滤过处理，pH调节，使部分杂质在处理过程中除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入成品。上样方法主要有湿法和干法两种。（3） 洗脱先用水清洗以除去树脂表面或内部还残留的许多非极性或水溶性大的强极性杂质（多糖或无机盐），然后用所选洗脱剂在一定的温度下以一定的流速进行洗脱。（4） 再生再生的目的：除去洗脱后残留的强吸附性杂质，以免影响下一次使用过程中对于分离成分的吸附。再生的方法：95%乙醇洗脱至无色，再用2%盐酸浸泡，用水洗至中性，再用2%NaOH浸泡，再用水洗至中性。注意：再生后树脂可反复进行使用，若停止不用时间过长，可用大于10%的NaCl溶液浸泡，以免细菌在树脂中繁殖。一般纯化某一品种的树脂，当其吸附量下降30%以上不宜再使用。三、 试剂及仪器仪器：紫外可见分光光度计，电子天平，恒温水浴振荡器，玻璃层析柱，恒流泵试剂：AB-8大孔树脂，大豆异黄酮，无水乙醇，盐酸，氢氧化钠四、 实验内容1、树脂的预处理用95%乙醇浸泡AB-8树脂24h后用去离子水洗至中性。然后用5%HC1溶液浸泡3h，用去离子水以洗至中性；再以5％NaOH溶液浸泡3h，水洗至中性后备用。2、 大豆异黄酮的定量检测方法将纯品大豆异黄酮配制成100仇g/mL的溶液，分别取0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL.0.6mL,0.7mL,0.8mL的上述大豆异黄酮溶液，加水稀释至5mL，采用紫外分光光度法，在261nm处测定吸光度，绘制标准曲线。3、 静态吸附等温线的测定准确称取湿树脂10g置于三角烧瓶中，加入50mLl%的大豆异黄酮溶液，放置于恒温水浴振荡器，控制温度30°C，吸附时间为lOmin,20min,30min,40min,50min,60min,90min,120min,150min时分别取1mL样液测吸光度，然后以时间t为横坐标，C/CO为纵坐标绘制吸附等温线（C为不同时间取样溶液的浓度，CO为初始样液的浓度）。4、 动态吸附实验在玻璃层析柱中装填10g湿树脂，选C/C0=0.05所用的时间为穿透时间，样液浓度10mg/mL，流速v=20d/min,以吸附时间为横坐标，C/CO为纵坐标绘制穿透曲线。计算平衡吸附量。5、 动态洗脱实验对上述达到动态吸附平衡的树脂柱