金莲花种质遗传多样性的aflp分析及金华方言的特指疑问代词

PAGE5-金莲花种质遗传多样性的AFLP分析摘要：金莲花是我国常用中药材品种，开展种质遗传多样性研究对新品种选育具有重要意义。本文利用AFLP标记技术对8份金莲花种质在基因组水平开展了遗传多样性分析，用POPGENE和NTSYS软件对统计结果进行遗传和聚类分析。从64对AFLP引物组合中筛选出的8对引物组合能够区分全部供试金莲花种质；研究结果表明，地理位置较近的金莲花种质，遗传相似系数较高；引种可造成金莲花种质的遗传结构发生变异。关键词：AFLP金莲花遗传多样性金莲花（TrolliuschinensisBge.），别名金梅草，金疙瘩，为毛茛科多年生植物，以花入药[1]。金莲花含有生物碱、黄酮甙、香豆素、挥发油、甾醇等药用成分，具有清热解毒、滋阴降火、养阴清热、消火杀菌等功效[2~3]，除药用外，还被开发成保健饮品，如金莲花茶等。近年，随着市场需求量的增长，野生金莲花储藏量逐年递减，金莲花野生资源受到严重威胁。尽管有少数金莲花品种已有在平原地区成功引种栽培的报道[4]，但绝大部分野生金莲花种质仍处于濒危状态。丰富的种质资源遗传多样性是金莲花育种的前提和先决条件，金莲花野生种质消亡不仅极大影响金莲花优良品种的选育，还将导致金莲花对环境适应能力的降低，不利于金莲花种群的生息繁衍。开展不同产地野生及栽培金莲花种群的遗传多样性研究，对探讨金莲花濒危机制、建立合理的金莲花种质资源保护策略以及金莲花优良品种选育等具有重要意义[5]。本文对采自河北、山西、北京郊区以及药用植物研究所引种栽培的8份金莲花种质开展了AFLP遗传多样性分析，研究了不同地理位置金莲花种质的遗传差异以及引种对金莲花种质遗传结构的影响，为今后开展金莲花种质资源保护及新品种选育提供了参考依据。一、材料与方法1.植物材料供试材料为不同产地采集的8份金莲花种质（表1），采回种子播种于中国医学科学院药用植物研究所试验田。苗期用健康、幼嫩的金莲花叶片提取基因组DNA，每份金莲花种质提取30个单株。表1供试金莲花材料编号采集地点种质名称生存状态备注B河北东灵山T.chinensis野生——D山西庞泉沟T.chinensis野生——C北京雾灵山T.chinensis野生——X河北围场T.chinensis栽培——G河北围场T.chinensis野生——S河北五岳寨T.chinensis野生——W北京栽培T.chinensis野生采自雾灵山T北京栽培T.chinensis栽培采自河北五岳寨2.AFLP分析（1）模板DNA的制备。称取0.2g金莲花新鲜叶片，用植物基因组DNA提取试剂盒（北京鼎国生物科技有限公司）提取金莲花基因组DNA。0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的纯度和完整性，根据标准的λDNA浓度将提取的金莲花基因组DNA统一稀释为50ng‧μL-1。（2）酶切和连接。反应体系为20ul，包括：模板DNA（50ng‧μL-1）4μL；MseI接头（50pmol‧L-1）和EcoRI接头（50pmol‧L-1）各1μL；EcoRI和MseI内切酶（10U‧μL-1）各2μL；10×PCR缓冲液2.5μL；ATP（10mmol‧L-1）2.5μL；T4连接酶（3U‧μL-1）1μL；用ddH2O补足20μL。样品混匀后在37℃保温5h，72℃温浴15min终止连接反应。取5μL连接产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切连接是否成功，剩余反应物（3）预扩增和选择性扩增。预扩增反应体系为25uL，包括：模板DNA2μL；预扩增引物（50ng‧μL-1）各1μL；dNTPs（2.5mmol‧L-1）1μL；10×PCR缓冲液2.5μL；TaqDNA聚合酶（3U‧μL-1）0.5μL，最后用ddH2O补足25uL。预扩增程序为：94℃2min；94℃30s，56℃30s，72℃80s，30个循环；72℃延伸5min。将预扩增产物用1×TE稀释20倍后作为选择性扩增的模板DNA。选择性扩增体系为25μL，包括：稀释后的模板DNA2μL；10×PCR缓冲液2.5μL；dNTPs（2.5mmol‧L-1）0.5μL；EcoRI和MseI引物（50ng‧μL-1）各1μL；TaqDNA聚合酶（3U‧μL-1）0.5μL；最后用ddH2O补足25uL。选择性扩增程序为：94℃30s，65℃30s，72℃80s，12个循环，退火温度下降0.7℃/循环；94表2用于AFLP分析的MseI引物和EcoRI引物名称核苷酸序列名称核苷酸序列EcoRI接头15’-CTCGTAGACTGCGTACCMseI接头15’-GACGATGAGTCCTGAGEcoRI接头25’-AATTGGTACGCAGTCTACMseI接头25’-TACTCAGGACTCATEA5’-GACTGCGTACCAATTCAMC5’-GATGAGTCCTGAGTAACEAAC5’-GACTGCGTACCAATTCAACMCAA5'-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3EAAG5’-GACTGCGTACCAATTCAAGMCAC5'-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3EAGG5’-GACTGCGTACCAATTCAGGMCAG5'-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3EACT5’-GACTGCGTACCAATTCACTMCAT5'-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3EACC5’-GACTGCGTACCAATTCACCMCTA5'-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3EACG5’-GACTGCGTACCAATTCACGMCTC5'-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3EAGC5’-GACTGCGTACCAATTCAGCMCTG5'-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3EACA5’-GACTGCGTACCAATTCACAMCTT5'-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3（4）电泳结果统计及数据分析。取1μL扩增产物，在PRISM377型测序仪（ABI，USA）上经4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2.4h，GeneScan3.1软件扫描凝胶图片，按照无带记为“0”，有带记为“1”的方法统计清晰、可辨的AFLP扩增条带，最终获得由“0”和“1”表示的数据阵列。用POPGENE1.32软件计算多态位点百分率（PPL）、观察等位基因数（Na）、Nei’s基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I），用于估计金莲花种群内及种群间的遗传多样性。用NTSYS-PC2.11F软件中的SimilarityQualitative命令求得DICE相似系数矩阵，用SANH中的非加权平均数（UnweightPair-GroupMethodusingarithmeticAverages，UPGMA）法对统计数据进行聚类分析，并最终由Treeplot命令生成聚类图。二、结果与分析1.金莲花种质的AFLP分析经0.8%琼脂糖凝胶检测，用试剂盒提取的金莲花基因组DNA条带清晰、明亮，而且没有明显的降解。金莲花基因组DNA经EcoRI和MseI双酶切及预扩增，从64对AFLP引物组合中筛选出8对扩增结果稳定、条带清晰、多态性高的AFLP引物组合，即：EACG/MCAC、EAGG/MCAC、EAGC/MCAG、EAGG/MCAG、EAGG/MCTA、EAGG/MCTC、EACC/MCTG和EAGC/MCTT。引物组合EACG/MCAC对部分金莲花种质的AFLP分析结果如图1所示。图1AFLP引物组合EACG/MCAC对金莲花种质的扩增结果金莲花种质遗传多样性分析结果显示，8份金莲花种质的金莲花的平均多态位点百分率为45.93%，平均观察等位基因数为1.4619，平均有效等位基因数为1.2381，平均Nei’s基因多样性指数为0.1424，平均Shannon信息指数为0.2178。就不同金莲花种质而言，多态位点百分率最大值为51.15%，最小值为40.11%；有效等位基因数最大值为1.2680，最小值为1.2050；Nei’s基因多样性指数最大值为0.1590，最小值为0.1230；Shannon信息指数最大值为0.2416，最小值为0.1885（表3）。根据对不同金莲花种质的AFLP分析结果，供试金莲花种质间的遗传多样性偏低。表3金莲花种质资源的遗传多样性分析种质多态位点百分率（%）观察等位基因数有效等位基因数Nei’s基因多样性指数Shannon信息指数D51.151.51161.24460.14900.2308B40.111.40111.20500.12300.1885C45.141.45141.24190.14340.2181X49.601.49601.26800.15900.2416G45.661.45661.24530.14600.2219S49.541.49541.25580.15340.2347W40.971.40971.20710.12370.1896T45.261.47341.23690.14180.2174合计45.931.46191.23810.14240.21782.金莲花遗传距离及聚类分析用NTSYSpc-2.11F软件对8份不同产地的金莲花种质进行遗传分析，获得了基于遗传相似性的聚类图（图2）。在阈值0.77处可将供试金莲花种质划分为四个类群：类群Ⅰ包括种质D、种质X、种质G和种质B。其中，种质X和种质G均来自河北围场，遗传相似系数较高；该组的种质B和种质D具有较近的地理位置，遗传相似系数也较高。类群Ⅱ包括种质C和种质W，均来自北京的雾灵山，种质C为野生种，种质W也是野生种，但在平原栽培过程中，因自然杂交种质W的遗传结构已经发生变化；类群Ⅲ和类群Ⅳ分别仅含种质S和种质T，均来自河北的五岳寨，但种质T经平原栽培后，遗传结构也发生了改变。图2金莲花不同种质的相似系数聚类分析图三、讨论AFLP是Zabeau等[6]发明的一种基于PCR扩增和分子杂交的分子标记技术。AFLP标记技术具有条带丰富、结果稳定等优点，被广泛应用于分子标记、遗传多样性、品种鉴定等研究[7~8]。本试验用AFLP方法对不同地区的8份金莲花种质开展了遗传多样性研究，试验结果表明，AFLP能够稳定、高效地扩增金莲花基因组DNA，对不同产地的金莲花种质能够有效区分，是开展金莲花遗传多样性研究的理想工具。根据对8份金莲花材料的聚类分析结果，山西庞泉沟、河北东灵山和河北围场的金莲花种质聚为一类，推测可能与它们所处的地理位置接近有关。北京雾灵山和北京栽培（原产雾灵山）的金莲花种质聚为一类，说明北京栽培（原产雾灵山）的金莲花种质遗传结构未发生显著变化。河北五岳寨和北京栽培（原产五岳寨）金莲花种质聚类分析结果却恰恰相反，说明北京栽培（原产五岳寨）的金莲花种质遗传结构在引种后发生了明显改变。参考文献中国医学科学院药用植物资源开发研究所主编.中国药用植物资源栽培学.北京：农业出版社，1991.丁万隆，陈震，陈君.金莲花属药用植物资源及利用.中国野生植物资源，2003，22(6)∶19~21.朱殿龙，丁万隆，陈士林，等.金莲花属植物的研究进展.世界科学技术-中医药现代化，2006，8(4)∶26~33.丁万隆，陈震，陈君，等.北京平原地区金莲花引种栽培研究.中草药，2003，34(10)∶附1~附4.李勇，丁万隆.我国部分金莲花种质资源遗传多样性的RAPD研究.植物遗传资源学报，2009，10(4)∶535~539.ZabeauM,VosP,Selectiverestrictionfragmentamplification∶ageneralmethodforDNAfingerprinting,EuropeanPatentApplication,PublicationNo.EP0534858,Paris∶EuropeanPatentOffice,1993杜鹃，马小军，李学东.半夏不同种质资源AFLP指纹系谱分析及其应用.中国中药杂志，2006，31(1)∶30~33.ZhangL,HuangBB,KaiGY,etal.AnalysisofintraspecificvariationofChineseCarthamustinctoriusL.usingAFLPmarkers.ActaPharmaceuticaSinica,2006,41(1)∶91~96.StudyongeneticdiversityofTrolliusChinensisgermplasmsbyAFLPLIYong，DINGWan-long，CHENShi-lin(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China)ZhuDinglong(DalianInstituteforDrugControl,Dalian,dalian116021,China)Abstract:TrolliuschinensisisoneofthetraditionalherbalmedicineusedinChina,studyonthegeneticvariationofthemhaveimportantsignificanceforbreedingprogram.GeneticdiversityofeightT.chinensisgermplasmswereanalyzedbyAFLP,andPOPGNEandNTSYSsoftwarewereusedforgeneticandphylogeneticanalysisofstatisticdata.Finally,eightoutofsixty-fourAFLPprimercombinationscandistinguishallT.chinensisgermplasmstested.Resultsindicatedthat,T.chinensiswithneargeographicdistancehavinghighergeneticsimilarity,andintroductionmayresultingeneticvariationofthem.Keywords:AFLP；Trolliuschinensis；Geneticdiversity课程名称：现代汉语金华方言的特指疑问代词任课教师：班级：综合文科姓名：学号：成绩：

金华方言的特指疑问代词摘要金华方言和普通话的特指问根据疑问代词类型都有问人、事物、数量、程度、处所、时间、原因、方式和目的九类。但两种语言的疑问代词各不相同。本文试图以举例和比较的方法讨论金华方言中特指问的疑问代词，力图解释金华方言的特点。关键词金华方言特指问疑问代词特点邵敬敏先生的《现代汉语通论》中指出：“陈述句中的每一项都可用疑问代词来替换，从而构成特指问句。疑问代词承担了特指问局的疑问信息，同时也形成了疑问焦点，所以希望对方针对疑问代词作出回答。”邵敬敏：《现代汉语通论》，上海教育出版社，2007.7，第215页金华方言的特指问从疑问代词的使用来看可分为问人、事物、数量、程度、处所、时间、原因、方式和目的九类。问人——哪个金华方言特指问中的问人一类在结构上与普通话相同，只将疑问代词代替陈述句中人物即可。普通话中问人的疑问代词有“谁”、“哪个”等，而金华方言中此类的疑问代词一般都使用“哪个”、“哪人”，而“谁”这个疑问代词的用法已经淡化甚至消失。例如：（1）侬是哪个/哪人？（你是谁？）（2）哪个和我一起去？（谁去搬一下凳子？）金华方言中问人一类的特指疑问代词在语言的变迁中逐渐有了一个用“哪个”代替其他所有细化问人疑问代词的趋势。从语法上来分析，“哪个”是一个非常特殊的疑问代词，它一方面相当于“谁”在普通话中的作用，具有名词性质，用于主谓句中，充当主语成分，也可以充当宾语成分。如上面的例句1，句中的“哪个”就作宾语存在，而在例句2中则作为主语存在。从语义上来分析，“哪个”一般作为施事，是动作行为的发出者，如例句（1）。但是在例句2中，“哪个”就成了系事，是连系动词连接的对象。二、事物——待、待西、待干在普通话中，关于事物的特指疑问代词一般是：“干吗”、“干什么”、“什么”。而金华方言中关于事物的特指疑问代词就比较唯一，关于物的特指疑问代词是“待”、“待西”，意思相当于普通话中的“什么”、“什么东西”。而关于事的特指疑问代词则是“待干”，意思相当于普通话中的“什么事情”。其中最重要的一个字，“待”，可直接定义为普通话中的“什么”，它一般不单独使用，但是普通话中的“什么”可以广泛使用。例如：（1）这个是待东西？里面有待西？（这是什么东西？里面有什么？）（2）侬来待事干/待干？或侬有待事干？（你来干什么？你有什么事？）“待”作为关于物的特指疑问代词，具有名词性质。“待事干”作为关于事的特指疑问代词，既有名词性质也有动词性质。而“待干”纯粹只有动词性质，是在“待事干”表示动词性质时的简缩表达。例如例句2中，前一句的“待事干”可用“待干”替换，而后一句中的代词作为名词性质则不能被替换。“待干”同普通话中的“干吗”一样可以单独使用。在金华方言中的“待”很特殊，从语法和语义上分析起来比较困难，不能明确归为一类。这里对例句作简单的分析。从例句（1）看来，“待”不能单独作名词性质来使用，后面必须跟上一个东西或事件，而普通话中的什么却可以直接使用。从例句2看来，当“待”和“事干”连起来使用时，既可以做名词，也可以做动词。例句（2）中，“待事干”可以直接充当谓语动词，而后一句中的“有”充当了谓语，“待事干”只能做宾语。从这一点可以看出，金华方言的疑问代词使用灵活多变，受语法的限制较普通话更小。三、数量——几很、几普通话中对应数量的疑问代词“几”和“多少”，在金华方言中也有“几”、和“多少”，金华市区方言现多用“几”和“多少”作为关于数量的疑问代词，已经同普通话同化。而金华市区周边的乡镇地区还保持使用“几”作为表示数量的特指疑问代词。例如：（1）侬家里好大，要几很钞票啊？（你家里好大，要多少钱啊？）（2）这袋苹果有几斤重？（这袋苹果有几斤重？）（3）侬儿几岁了？（你儿子几岁了？）从上面的例子看来，金华方言中关于数量的特指疑问代词“几很”的作用很大，可以覆盖“多少”的指代作用。在特指疑问句中，所有用多少表示的疑问都可以用“几很”替换表示。但在像市区这样的地方，语言变化发展比较迅速，“几很”的作用渐渐被淡化，人们多使用“几”和“多少”，只有在市区周边发展较缓慢的乡镇地区还保留着“几很”的用法。“几”的用法很普遍，但一般都会有一个量词补充修饰。如例句（2）和（3）中的“几”后面都跟上了一个量词使用。四、程度——几很在金华方言中，关于程度的特指疑问代词和关于数量的相同，也是“几很”。而在普通话中，则是“多”为主。例如：（1）侬有几很吃力？（你有多累啊？）（2）几很要紧的事啊？（多要紧的事啊？）金华方言中关于表示程度的特指疑问代词非常统一都用“几很”和“多少”充当。金华方言中对数量和程度的表示，区分意识比较弱。五、时间——几时、待时节由于金华方言在数量、程度、时间三方面的疑问代词都可用“多少”、“几”和“几很”表示，在这里就着重强调表示时间的疑问代词的一个具有金华地方性的表示方法。金华方言中常常出现用“几时”作为表示时间的疑问代词。另外“待时节”在问时间的特殊疑问句中使用非常频繁。“几时”和“待时节”都是关于时间点的疑问指示代词，而关于时间段或者说是时间长度的疑问句中常用“几下”表示，“几下”一次在金华方言词典中无从查找，或许有其他方言同音代替用词。例如：（1）待时节啦？（什么时候啦？）（2）侬几时转来？（你什么时候回来？）（3）侬要去几下？（你要去多久？）关于时间的特指问，在普通话中主要以“什么时候”和“多久”分别作代词，其相关程度较低，都是各行其是。而在金华方言中，关于时间都离不开“”这个字，而时间段和时间点的区分明显，代词用“几下”和“几时”、“待时节”来分别指代，既生动又形象，和处所方位代词又具有一定的关联。六、处所——哪里、哪汏金华方言中关于处所的特指问的疑问代词已经蜕化到和普通话大致相同，一般都用“哪里”、“哪汏”作为处所的疑问代词，只在语音方面还留有一些区别。例如：（1）侬归去哪里/哪汏？（你回去哪里？）（2）侬自哪里/哪汏来？（你从哪里来的？）不论是从语法还是语义语用上分析，金华方言中的处