乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书

乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书-模板目的 采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。范围适用于乙型肝炎病毒核酸（HBVDNA）定量检测（PCR-荧光探针法）。3.职责3.1操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。3.2专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。3.3实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。4.原理采用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样品核酸纯化之后，通过荧光定量PCR对HBVDNA进行扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT)实现对未知样品的检测。另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。5.样品要求5.1适用样品类型：血清或血浆。5.2样品采集：5.2.1血清用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。5.2.2血浆用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂的真空采血管，立即轻轻颠倒混匀5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后分离血浆于无菌的1.5ml灭菌离心管。5.3样品保存和运送使用专用样品0℃冰壶送检，温度约维持在4℃左右。分离后的血清或血浆可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。5.4拒收样品：拒绝重度溶血样品、肝素抗凝的血浆。6.仪器和试剂6.1仪器AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。6.2试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司产品标准批号：YZB/国7265-2013线性范围：100IU/ml-5×108IU/ml最低检出限及定量限：最低检出限浓度为30IU/ml，最低定量浓度为100IU/ml。试剂各组分见表1：表1试剂盒组分表组分名称规格数量核酸提取试剂DNA提取液Ⅰ4.5ml/瓶2质控品及阳性定量参考品阴性质控品250ul/管1HBV强阳性质控品250ul/管1HBV临界阳性质控品250ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×106IU/ml）250ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×105IU/ml）250ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×104IU/ml）250ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×103IU/ml）250ul/管1PCR检测试剂PCR内标溶液100ul/管1HBVPCR反应液270ul/管2Taq酶60ul/管17.操作步骤7.1试剂准备（试剂储存和准备区）7.1.1进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面。7.1.2取出N个（N=待测样品数+8=待测样品数+4个HCV阳性定量标准品+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品+空白孔）PCR反应管，HBV单人份扩增体系配制如下表2：表2反应液配制表组分HBV反应液Taq酶总体积用量/人份27ul3ul30ul将各组分充分混匀，混合好后进行瞬时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将30ul扩增体系分装到PCR反应管，反应液分装时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区。7.2DNA提取（标本制备区）7.2.1进入标本制备区，从传递窗中取出PCR反应管，将其放入标本制备区冰箱冷藏。7.2.2从冰箱取出待测样品、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、DNA提取液Ⅰ和内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。7.2.3打开金属浴，调节温度为100℃，使7.2.4用镊子夹取按需要量准备的1.5ml灭菌离心管放于安全柜内离心管架上，所需离心管数为样品数+8。7.2.5向离心管中各加入450ulDNA提取液Ⅰ和4ul内标溶液，再按编号加入200ul样品，离心管与样品对应编号，每个离心管的编号方向都要朝向管口开启的方向。用振荡器剧烈震荡混匀15s，瞬时离心数秒。7.2.6将离心管放入金属浴，100℃恒温处理10±1min7.2.7温育10min后，用镊子从金属浴中取出所有离心管，室温静置冷却。12000g，离心5min，备用。（摆放离心管时要将离心管开口朝向内侧。）7.2.8从标本制备区冰箱冷藏室取出分装好的HBVDNAPCR反应管，向对应编号的PCR管中加入处理好的的样品（包括样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品）上清液各20ul，空白对照不加模板，盖紧反应管。8000rpm离心数秒，经传递窗移至扩增检测区。（用移液枪小心吸取上清液，尽量不要碰到底层沉淀。）7.3PCR扩增（扩增区）7.3.1从传递窗中取出PCR反应管，放入仪器样品槽内。7.3.2按对应顺序设置空白管、阴性质控品、阳性室内质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品及待测样品，并在“samplename”一栏中设置样品名称，探针检测模式设置：ReporterDye1：FAM，QuencherDye1：none；ReporterDye2：VIC，QuencherDye2：none；PassiveReference：Rox。具体设置方法参考《AB7500核酸扩增仪标准作业指导书》。7.3.3打开Run窗口设置循环条件：93℃2min；93℃45s55℃60s10个循；9330s5545s，30循环。7.3.4保存文件，运行仪器。8.结果分析8.1反应结束后，操作人员可根据实际情况自行调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值。Start值可以在3-15，End值可设在5-20。在Log图谱窗口设置的Threshold的Value值，使基线位于扩增曲线指数期，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线，点击Analysis自动获得分析结果在Report界面查看结果，记录样品数值（C）。8.2如果在FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期或CT值等于30，在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期，则判定样品的HBVDNA浓度小于检测灵敏度。8.3如果在FAM检测通道扩增曲线有对数增长期且CT值小于30，则按以下方法判断：（1）若样品的C﹤100，则样品的HBVDNA浓度﹤100IU/ml；（2）若样品的100﹤C﹤5.0E+008，则样品的HBVDNA浓度＝CIU/ml；（3）若样品的＞5.0E+008，则样品的HBVDNA浓度＞5×108IU/ml；如需要精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后在检测。则该样品的HBVDNA浓度＝（C×稀释倍数）IU/ml。9.质量控制 每次实验均需检测阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界阳性质控品。质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判断。9.1试剂盒自带质控（1）阴性质控品：FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期或CT值＝30，VIC检测通道扩增曲线为明显对数增长期；（2）HBV阳性质控品：FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期且CT值＜30，强阳性质控品定值范围在2.0×105IU/ml~8.0×106IU/ml，临界阳性质控品定量定值范围在3.0××102IU/ml~1.0×104IU/ml；（3）HBV阳性定量参考品：FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型曲线，CT值＜29，且R2≥0.98。9.2室内质控每次实验应选择适当的HBVDNA质控品作室内质控，将阳性质控品的数据填入质控图。9.3以上要求（9.1和9.2）需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需从新进行。10.干扰因素10.1临床标本中内源性抑制物：血红蛋白、免疫球蛋白、白细胞内乳铁蛋白、脂类等都可抑制PCR反应，标本应避免溶血、脂血、黄疸等。10.2外源性抑制物：肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、手套上的滑石粉、标本容器上的抑制物等，标本应按采集要求采集，操作中应小心谨慎，标本容器及实验用具应合格。10.3标本的交叉污染：操作过程中应仔细认真，防止交叉污染，尽量使用带鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取，以及时发现交叉污染。11.生物参考区间：1×102IU/ml~5.0×108IU/ml12.警示/危急值：HBVDNA检测无警示/危急值。13.异常结果处理如遇HBVDAN检测结果与临床诊断或资料，或与近期历史检测结果不相符合，应及时与临床医生联系、沟通，查找原因并采取措施，于《疑问报告发放处理记录表》中记录处理过程。如需复查，需及时保存标本。14.临床意义14.1HBVDNA是乙型肝炎病毒感染的最直接的证据，较其他血清学标志物（如HBsAg、HBeAg）更有价值。14.2HBVDNA测定有助于阻断母婴传播的判断和检测，HBVDNA阳性的产妇，其婴儿随访中60%为HBV感染，而HBVDNA阴性的产妇，其婴儿随访无一例阳性。14.3HBVDNA测定有助于HBsAg阴性的慢性肝炎的诊断和鉴别诊断，在血清学试验HBsAg阴性的人群中，至少有3-4%的HBV携带者，由于HBV的S基因突变，属于HBsAg表达缺陷或低水平表达而无法常规检出，利用HBVDNA方法的敏感性，可以对HBsAg阴性的慢性肝炎进行检测，还可以区分慢性乙型肝炎和非甲非乙型肝炎。14.4HBVDNA测定可作为抗病毒治疗疗效的判断指标。15.变异的潜在来源标本保存不当或反复冻融，都会影响检测结果的准确。16.注意事项16.1实验过程中必须穿专用工作服、戴手套、口罩、帽子、必要时戴防护眼罩，接触标本后必须及时更换手套。16.2阳性质控品和检测样品均应视为具有传染性物质，应避免接触到皮肤和粘膜。16.3实验过程必须严格分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用。16.4样品的处理操作应在生物安全柜内进行。16.5所用检测试剂使用前应完全解冻，瞬时离心后使用，应避免反复冻融。16.6样品核酸提取后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于-20℃待用（24h）。16.7操作过程中应防止交叉污染，尽量使用鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取。16.8加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，尽快盖紧管盖。上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。16.9标本制备区所用到的试管、吸头等需打入盛有消毒剂的容器，并与废物一起灭菌后方可丢弃。16.10扩增完毕立即取出反应管，密封