【生物课件】基因工程的基本操作程序 2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3

基因工程的基本操作程序基因工程基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，用于防治棉花虫害已有多年历史苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。Bt蛋白分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。Bt蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指编码蛋白质的基因。目的基因目的基因编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列有调控作用,上游有启动子，

下游有终止子基因结构——真核细胞非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞基因结构②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子基因结构——原核细胞原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、________的相同点都由能够编码蛋白质的__________和具有调控作用的__________区组成的连续不连续编码区非编码基因结构——原核细胞01目的基因的获取——从基因组文库中获取含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。如何获取目的基因？将整个基因组DNA片段切割成大小合适的片段将这些片段分别与载体连接起来导入受体菌的群体中储存基因组文库提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库基因组文库的构建01目的基因的获取——从基因组文库中获取cDNA文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库逆转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存RNA水解若有控制目的基因合成的mRNA，是否可以知道目的基因核苷酸顺序？01目的基因的获取——从cDNA文库中获取cDNA文库包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合成为该组织细胞的cDNA文库。推测：cDNA文库和基因组文库相比，得到的基因不含哪些结构？文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中有无启动子基因中有无内含子基因多少小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因01目的基因的获取——从cDNA文库中获取

为什么用生物发育某个时期的mRNA反转录得的DNA只有这种生物的部分基因？某个时期的发育是基因选择性表达的结果DNA合成仪推测推测合成蛋白质的氨基酸顺序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因若已知目的基因表达出的蛋白质种氨基酸的排列顺序，能否知道目的基因的碱基排列顺序？01目的基因的获取——通过化学合成法从基因文库中直接获取化学合成法PCR扩增基因组文库cDNA文库全部基因含启动子、内含子部分基因不含启动子、内含子序列明确且分子量小目的基因的获取获取的基因有没有启动子和终止子？02基因表达载体的构建（核心工作）获得了足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？目的：确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。思考：基因表达载体要有哪些元件？各个元件有什么作用？目的基因：能控制表达所需要的特殊性状启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。复制原点：DNA复制的起始位点终止子：位置：基因的下游功能：终止转录标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。02基因表达载体的构建辨析：02基因表达载体的构建载体≠表达载体：相同点：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。区别：表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。启动子和终止子起始密码子和终止密码子本质DMA片段mRNA上三个相邻碱基位置DNA分子上RNA分子上作用起始和终止DNA的转录起始和终止翻译的过程02如何构建抗虫棉的基因表达载体？目的基因应该插入到载体的哪个位置？①

用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。②

用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③

将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。载体基因表达载体02基因表达载体的构建03将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法我国科学家独创常用转化的概念:目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定并表达的过程，称为转化。基因枪法1.方法Ca2+处理感受态细胞：使用Ca2+处理可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。Ca2+处理细胞感受态细胞重组基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子03将目的基因导入受体细胞Ca2+感受态细胞吸收导入微生物细胞42℃,1min冰上3min筛选重组表达载体03（1）常用方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵①体积大，易操作。②易表现出全能性。（3)过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物03将目的基因导入受体细胞导入动物细胞（1）花粉管通道法（我国科学家独创）②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。目的基因目的基因适用生物：开花植物03将目的基因导入受体细胞导入植物细胞03（2）农杆菌转化法

转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。03将目的基因导入受体细胞导入植物细胞大型环状DNA（可转移的DNA）农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。对象：双子叶植物和裸子植物2203（2）农杆菌转化法目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达03将目的基因导入受体细胞导入植物细胞Ca2+处理构建重组Ti质粒时用到了哪些酶？为什么一定要将目的基因插入到T-DNA上？将基因表达载体导入农杆菌时应怎样处理农杆菌？受体细胞是普通细胞是否能得到转基因植物？（2）农杆菌转化法03将目的基因导入受体细胞导入植物细胞两次拼接两次导入1.将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上2.重组Ti质粒的T-DNA整合到该细胞的染色体DNA上（非人工操作）1.Ca2+转化法将重组质粒转入农杆菌2.农杆菌侵染植物细胞（非人工操作）①转基因植物用

；②转基因动物用

(一般不能用体细胞)；

原因是：

。③微生物作为受体细胞的优点是

。④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等则受体细胞为

，原因是

；⑤一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是

。真核细胞分泌蛋白等需内质网、高尔基体等的加工受精卵有发育的全能性无核，无器，不能合成蛋白质体细胞或受精卵受精卵单细胞，繁殖快；遗传物质相对较少，易于培养操作03将目的基因导入受体细胞2.受体细胞的选择2504将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？04目的基因的检测与鉴定2604思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？Bt基因mRNABt抗虫蛋白抗虫棉PCR与核酸分子杂交等技术检测抗原—抗体杂交技术分子水平抗虫鉴定（个体水平）04目的基因的检测与鉴定①.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法：PCR检测DNA半保留复制原理：碱基互补配对04目的基因的检测与鉴定04目的基因的检测与鉴定①.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法：DNA分子杂交技术1.RT-PCR（逆转录PCR）2.RNA分子杂交RNA分子杂交(NorthernBlot)04目的基因的检测与鉴定②.检测目的基因是否转录出了mRNA③.检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：抗原-抗体杂交技术原理：抗原抗体的特异性结合苏云金杆菌提取Bt抗虫蛋白标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交抗原转基因生物04目的基因的检测与鉴定转Bt基因非转基因2.个体水平的检测没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株接种棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达实例：鉴定转基因抗虫棉是否培育成功04目的基因的检测与鉴定1.目的基因的筛选和获取-前提利用PCR获取和扩增化学方法人工合成2.构建基因表达载体-核心目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞