几种菌种的保存及复苏方法及极有趣味的语文游戏-适合语文课堂教学

几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）

定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

操作步骤如下：

1培养基制备

1.1器皿准备

培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

1.2溶解培养基配料

先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。

1.3调pH值

配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

1.4加凝固剂

配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。

1.5过滤分装

在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。

1.6包扎标记

将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

1.7灭菌

根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。

1.8斜面摆放

灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

1.9无菌检查

将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

2接种

2.1斜面接种

2.1.1点接

把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。

2.1.2中央划线

从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。

2.1.3稀波状蜿蜒划线法

从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。

2.1.4密波状蜿蜒划线法

从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。

2.1.5挖块接种法

挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。

2.2穿刺接种

用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等。

2.3液体接种

挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。

3培养

将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。

4保藏

培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1～3个月移植一次。

保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。

斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。

液体石蜡保藏法

亦称矿物油保藏法,定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。

操作步骤如下：

1液体石蜡的准备

选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，采用以下两种方式进行灭菌：

121℃湿热灭菌30min，置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。

160℃干热灭菌2个小时，冷却后，经无菌检查后备用。

2斜面培养物的制备

参照定期移植法。

3灌注石蜡

将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入培养好的新鲜斜面培养物上，液面高出斜面顶部1cm左右，使菌体与空气隔绝。

4保藏

4.1注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4～6℃）干燥处保藏，保藏时间2～10年。

4.2保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。

5恢复培养

恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。

3.标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备

3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球

3.2培养基

改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.用于白色念珠菌复苏、复壮.

液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.

营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。

3.3操作步骤：

a.打开洁净工作台。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。

c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。

d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8ml到安瓿中。

e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。

f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。

g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。

h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。

i.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。

j．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。

3.4菌种确认

用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。

3.5污染处理

假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管

3.6菌种的传代与保藏

将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代。

菌种的传代保藏过程

3.3项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第3代。工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3）。

定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：

（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。

（2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。

（3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。

（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。

（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。

（6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。

（7）将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱最多培养7天。

当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4）。按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。

菌种斜面的培养、保藏条件及时间

菌种培养条件及时间培养基保存条件及时间

大肠埃希菌(CMCC(B)44102)30～35℃22～24h营养琼脂培养基2℃～8℃保存3个月

金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)30～35℃22～24h营养琼脂培养基2℃～8℃保存3个月

枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)30～35℃22～24h营养琼脂培养基2℃～8℃保存3个月

铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)30～35℃22～24h营养琼脂培养基2℃～8℃保存3个月

乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094)30～35℃22～24h营养琼脂培养基2℃～8℃保存3个月

生孢梭菌(CMCC(B)64941)30～35℃22～24h营养琼脂培养基2℃～8℃保存3个月

白色念珠菌(CMCC(F)98001)23～28℃最多7天改良马丁琼脂培养基2℃～8℃保存3个月

黑曲霉(CMCC(F)98003)23～28℃最多7天改良马丁琼脂培养基2℃～8℃保存3个月

短小芽孢杆菌(CMCC(B)63602)30～35℃22～24h营养琼脂培养基2℃～8℃保存3个月

注：菌种斜面1次/周观察状态是否正常。

3.7菌种的使用及销毁

每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。如果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。

每次操作，都应进行记录。菌种管上应贴有牢固的标签。标明菌种名称、菌种代号、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。

废弃菌种及实验用品废弃物的处理：121℃高压蒸汽灭菌20分钟。并对操作过程进行记录。极有趣味的语文游戏－适合语文课堂教学极有趣味的语文游戏玩法：第一轮：选拔题1、成语对对子（注意对仗要工整，意思要相对）。例：粗茶淡饭（山珍海味）答案：流芳百世（遗臭万年）指鹿为马（点石成金）精雕细刻（粗制滥造）雪中送炭（锦上添花）伶牙利齿（笨嘴拙舌）2、说出有“舌”字的成语，说得最多的胜出。答案：七嘴八舌、妄口八舌、闲嘴淡舌、唇枪舌剑、张口结舌、笨嘴笨舌、鹦鹉学舌等。3、各举出以一、二、三、四、五、六、七、八、九、十开头的俗语（包括成语、惯用语等）。例如：一是一，二是二答案：一不做,二不休一心一意二一添作五三心二意三下五除二三人同行，必有我师四通八达五花八门六六大顺七上八下八九不离十八仙过海，各显神通九九归一九牛二虎之力十有八九十拿九稳4、下面人名各取自什么成语？杜鹏程（鹏程万里）陈残云（风卷残云）王任重（任重道远）刘海粟（沧海一粟）丁慧中（秀外慧中）焦若愚（大智若愚）5、成语填空第一组：（心）服（口）服（以）德（报）德（以）讹（传）讹（以）牙（还）牙（倚）老（卖）老（将）计（就）计第二组：神（乎）（其）神精（益）（求）精痛（定）（思）痛欺（人）（自）欺日（复）（一）日微（乎）（其）微8、怪体诗如何读？龙虎虎望山山山湖湖湖湖湖海海海海会仙仙仙仙仙仙仙仙(一龙二虎望三山,五湖四海会八仙)第二轮：初级1、“大珠小珠落玉盘”所形容的是什么乐器的弹奏声？A、琵琶B、古筝C、扬琴2、《孔雀东南飞》里，刘兰芝"十三能织素，十四学裁衣，十五弹箜篌，十六诵诗书”，请问，“箜篌”是什么乐器：A、拨弦乐器B、击弦乐器（A）3、"有板有眼"的"板"是我国传统音乐节奏中的：A、强拍B、弱拍（A）4、我们常说"隔着门缝看人”，当我们隔着门缝看人时，看到的人：A、比原来扁了B、和原来一样C、比原来宽了（B）5、在古代，“爵”是一种什么器皿？A、食器B、酒器（A）6、“白雪公主”这个形象最早来自于：A、格林童话B、安徒生童话C、伊索寓言（B）7、在“精卫填海”的故事里,"精卫”是A、一个人B、一只鸟C、一只猴子D、一条龙（B）8、王昭君没有得到汉元帝的召见而远嫁匈奴单于，是因为：A、王妃对她的陷害B、画师歪曲她的形象C、大臣说她的坏话（B）9、安徒生童话《海的女儿》里，小美人鱼变成人是为了见到谁？A、渔夫B、皇后C、王子（C）10“卧薪尝胆”说的是：A、夫差B、范蠡C、管仲D、勾践（D）第三轮：擂台题从上面剩下的题目选。1、第一次抢答你知道下面的惯用语是什么吗？把在团体中起主导的人喻为（主心骨）把足智多谋的人喻为（智多星）把接待宾客的当地主人喻为（东道主）把公堂台阶下受审的囚犯喻为（阶下囚）把吝啬钱财、一毛不拔的人喻为（铁公鸡）把混混噩噩、不明事理的人喻为（糊涂虫）把世故圆滑的人喻为（老油条）把没有专业知识的外行人喻为（门外汉）把技艺不精、勉强凑合的人喻为（三脚猫）2、第二次抢答数字猜成语（小黑板）12345609（七零八落）1256789（丢三落四）1+2+3（接二连三）333555（三五成群）3.5（不三不四）510（一五一十）9寸+1寸=1尺（得寸进尺）3、第三次抢答说出歇后语的后半部分：矮子坐高凳--够不着八月的核桃--挤满了人（仁）稻草人救火--引火上身、同归于尽擦脂粉进棺材--死要面子炒咸菜放盐巴--太闲（咸）了厕所里挂个钟--有始有终外甥打灯笼--照舅猪鼻子插葱--装象一、成语对对子：（注意对仗要工整，意思要相对）井然有序（杂乱无章、混乱不堪）指鹿为马（点石成金）固若金汤（危如朝露、不堪一击）流芳百世（遗臭万年）雪中送炭（锦上添花、火上浇油）伶牙利齿（笨嘴拙舌）精雕细刻（粗制滥造、粉妆玉砌）粗茶淡饭（锦衣玉食）二、成语不离“舌”形容信口胡说（枉口拔舌）形容惊诧无言（张口结舌、瞠目结舌）形容能说会道（唇枪舌剑、巧舌如簧）形容不善辞令（笨嘴拙舌）形容随声附和（鹦鹉学舌）形容人多嘴杂（七嘴八舌）形容说话轻薄（轻嘴薄舌、油嘴滑舌）三、数字俗语：表示实实在在，不可更改时用（一言为定）表示做事不考虑周到，干了再说时用（不管三七二十一）表示一样东西两人平分时用（二一添作五）表示某人干事麻利时用（三下五除二）表示差不多时用（八九不离十）表示某人打小算盘时用（小九九）表示归根到底时用（九九归一）表示把握大时用（十拿九稳）表示很不容易时用（九牛二虎之力）表示信心十足时用（万无一失）表示距离远时用（十万八千里）四、下面人名各取自什么成语？杜鹏程（鹏程万里）陈残云（风卷残云）王任重（任重道远）刘海粟（沧海一粟）丁慧中（秀外慧中）甘如饴（甘之如饴）焦若愚（大智若愚）五、成语填空：（心）服（口）服（以）德（报）德（以）讹（传）讹（以）牙（还）牙（倚）老（卖）老（将）计（就）计神（乎）（其）神精（益）（求）精痛（定）（思）痛欺（人）（自）欺将（门）（有）将日（复）（一）日微（乎）（其）微六、宝塔诗如何读？开山满桃山杏山好景好来山客看山里山僧山客山山中山路转山崖（这首诗这样读的:山中山路转山崖山客山僧山里来山客看山好景好山桃山杏满山开）七、怪体诗如何读？龙虎虎望山山山湖湖湖湖湖海海海海会仙仙仙仙仙仙仙仙万国州州州州州州州州州掉川川川川（数一数龙虎山湖海仙州川便知一二：一龙二虎望三山，五湖四海会八仙，万国九州掉四川。）八、下列对联各咏的是谁？1、一门父子三词客，千古文章四大家。（三苏、韩愈、柳宗元、欧阳修、苏轼）2、豪气压群雄，能使力士脱靴，贵妃捧砚；仙才媲美，不让参军俊逸，开府清新。（李白）3、玉帐深宵悲骏马，楚歌四面促红妆。（项羽）4、四面湖山归眼底，万家忧乐到心头。（范仲淹）九、你知道下面的惯用语是什么吗？1、把在团体中起主导的人喻为（主心骨）2、把足智多谋的人喻为（智多星）3、把接待宾客的当地主人喻为（东道主）4、把公堂台阶下受审的囚犯喻为（阶下囚）5、把吝啬钱财、一毛不拔的人喻为（铁公鸡）6、把混混噩噩、不明事理的人喻为（糊涂虫）7、把世故圆滑的人喻为（老狐狸）8、把没有专业知识的外行人喻为（门外汉）9、把技艺不精、勉强凑合的人喻为（南郭先生）十、数字猜成语：12345609（七零八落）1256789（丢三落四）1+2+3（接二连三）333555（三五成群）3.5（不三不四）510（一五一十）9寸+1寸=1尺（得寸进尺）十一、巧用标点有位书生到亲戚家串门，顷刻间外面就下起雨来，这时天已将晚，他只得打算住下来。但这位亲戚却不乐意，于是就在纸上写了-一句话:下雨天留客天留人不留书生看了，即刻明臼亲戚的意思，却又不好明说，就心想一不做、二不休，干脆加了几个标点:下雨天，留客天，留人不?留!亲戚一看，这句话的意思完全反了。也就无话可说，只好给书生安排了住宿。其实，这句话除了书生标点的这一种办法外。还有三种标法，可分别使它变成陈述、疑问、问答三种句式，请你加上标