0809胶体金快速免疫诊断技术

ColloidalGoldLateral-FlowDiagnosticTechnology

胶体金免疫层析快速诊断技术------闵微，研发部快速检测快速检测是一种廉价的、一次性的、基于膜的检测方法，它能提供分析物存在于液体样品的视觉证据。这种检测可以以独立的试纸条，也可以以装在塑料盒中的方式进展。总的来说，做此项检测至少需求200ul的液体标本，可在2至5分钟内完成。在临床检测中，样品能够有尿、血液、血清、唾液或其他体液。在非临床检测中，样本能够是由土壤、粉尘、植物或者食品制备的微量溶液，它们同样可以直接运用膜试纸条检测。这种检测方法无需仪器操作，可运用于临床、实验室、室外或者家庭——通常为无操作阅历人员运用。2快速膜检测需求广泛，可运用于诸多领域〔见下表〕。随着灵敏度和特异性的提升，大量的潜在运用能够是作为替代昂贵仪器检测方法的低本钱选择。34为何运用金标志早期的快速检测运用有色胶乳构成可视信号，目前的某些检测仍运用此手段。过去和如今，乳胶法不断是凝集反响主要的标志方法，这是由于它在结合成分的存在下易于凝集。对于快速检测而言，交联物的稳定性是防止假阳性的关键，而易于凝集能够就是其产生假阳性的主要问题。由于具有更好的潜在稳定性，20世纪80年代末，金标志被引入膜快速检测中。在适当的消费条件下，任何被准确大小的金颗粒都可以被重现性制造出来。不同的大小可用于不同的用途。其优良的稳定性、敏感性、准确性及可反复消费性等特点使得金适宜于在快速检测中的运用。金本性属惰性元素，被适当加工可构成完好的球形颗粒。当正确衔接时，蛋白质能结实地结合在金颗粒外表，无论是液态或固态都能坚持长久的稳定性。而且，假设是在制造过程中蛋白被准确固定，其与金交联物的非特异性结合可被减至零。56胶体金技术来源及现状来源1971年,Faulk和Taytor引入

7原理免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物运用于抗原抗体的一种新型的免疫标志技术。胶体金是由氯金酸〔HAuCl4〕在复原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体形状，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团构成结实的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、外形及颜色反响，加上结合物的免疫和生物学特性，因此使胶体金广泛地运用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。8现状层析法(Lateral-Flow)渗滤法(Through)免疫金银染色法胶体金的作用:指示剂910与常规诊断方法相比优点缺点快速：全部检测过程仅需3-10分钟。简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行。廉价：单个测试条成本极低

可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，可立刻拿到结果，不必等待。

稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。

检测标本种类多：既可用于查血，又可用于检尿或唾液，因而适合各种检查定量问题灵敏度问题11技术运用类别应用领域检测的物质人类医学各级医院,血站,CDC,防疫站,诊断中心；家庭自检；商检系统；边检口岸；公安系统.传染病（乙肝五项,HIV,SARS等）标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕),LH,FSH)毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒）农牧业畜牧兽医站,商检系统,边检口岸,农牧类院系和研究所传染病（禽流感,兽瘟疫等）病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等）环境环保监测部门,研究机构有害物质超标食品安全食品安全检测中心,各监管部门农兽药残留（磺胺类、瘦肉精等）,大肠杆菌,黄曲霉素12胶体金层析法一个快速检测的底层普通是硝酸纤维素膜，在它上面固定了检测蛋白，通常是抗体或抗原。衔接着膜的是包含有枯燥金标的金标垫〔通常是玻璃纤维〕。对于目前大多数可做的检测工程，这种结合垫含有吸附了针对待检分析品的特异性抗体或抗原的金粒子。样品垫通常为纸质，附着着结合垫。当运用样品垫时，液体样品经过毛细分散作用穿移过结合垫，再水化金交联物，使待分析样品与交联物相互作用。然后金交联物与待分析样品复合物转移至膜条带上再移向蛋白结合物，复合物在此处被固定后以一条细细的红线的方式产生明显的信号。第二条线是控制线，由余下的金交联物构成于膜上，阐明测试完成。13试纸条组成构造测试线〔T线〕控制线〔C线〕胶体金垫吸水滤纸样品垫NC膜〔硝酸纤维素膜〕层析方向PVC底板14层析法技术优势:简单\现场\快速1.翻开包装取出试纸条2.直接插入待测样品中3.目测读出结果〔3-10分钟内〕15免疫层析法检测原理分类引见

〔双抗体夹心〕〔以HCG检测为例〕16免疫层析法检测原理分类引见

〔竞争反响〕〔以吗啡检测为例〕17免疫层析法检测原理分类引见

〔运用proteinA金标〕〔以HIV检测为例〕胶体金渗滤法将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤安装。在加抗原〔抗体〕后，迅速加抗体〔抗原〕，再加金标志第二抗体，由于有渗滤安装，反响很快，在数分钟内即可显出颜色反响。此方法已胜利地运用于人的免疫缺陷病病毒〔HIV〕的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。18胶体金银染色法胶体金银染色法〔Dot－IGS／IGSS〕是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反响后，再滴加胶体金标志的第二抗体，结果在抗原抗体反响处发生金颗粒聚集，构成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法〔Dot－IGS〕。此反响可经过银显影液加强，即斑点金银染色法〔Dot－IGS／IGSS〕。1920胶体金免疫层析系统

技术道路21技术道路胶体金制备技术标志技术NC膜与溶液喷点胶体金垫与溶液喷点样品垫吸水纸粘性底板枯燥方法溶液体系分析装配\切条\包装胶体金的制备22制备原理一切的消费方法都是运用复原剂提供电子给溶液中带正电荷的金离子而产生金原子，如下所示：氯金酸＋复原剂＝胶体金HAuCl4+e–=Au0通常运用的复原剂包括柠檬酸钠、黄磷、硼氢化钠、硫氰酸钠。2324根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标志探针，其直径应在3-30nm范围内。在氯化金〔HAuCl4〕水溶液中参与复原剂使之复原并聚积构成胶体金粒子。运用不同种类、不同剂量的复原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反响溶液中最初复原试剂和复原核的数量。复原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的复原也就从更多的复原中心开场，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每添加一倍，数量减少为原来的1/8。25以柠檬酸钠和单宁酸做复原剂，可以制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。因此普通胶体金探针均运用该方法进展。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2可以去除这些残基。双标志或制备5-10nm的胶体金时建议运用该方法。利用柠檬酸为复原剂，可以制备12～150nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时添加。因此做单标志时，建议运用该方法制备12-16nm直径的胶体金。除了上述方法外，也可以用磷作为复原剂来制备5nm的胶体金，它防止了单宁酸残基的问题，但所构成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处置，故该方法曾经很少运用。26白磷复原法制备5nm胶体金取250ml三角瓶一个，加79ml双蒸水，1ml1%氯化金，并用0.25MK2CO3将溶液调至中性〔pH7.0〕。取0.2ml饱和磷/乙醚溶液加到1.5ml试管中，再加0.8ml乙醚，混匀。取0.7ml参与溶液〔1〕中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用CuSO4进展中和)。室温下悄然摇匀15min，然后加热沸腾并坚持5min，自然冷却。27单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16nm胶体金取一250ml三角瓶，参与79ml双蒸水和1ml1％氯化金，预热至60～70℃。取一50ml烧杯，参与4ml1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小参与不同用量的单宁酸及等量的25mMK2CO3。预热至60～70℃。K2CO3的作用是坚持溶液的中性pH。因此假设单宁酸的量少于0.5ml时，对pH的影响不大，K2CO3可以省略。将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。自然冷却。28柠檬酸钠（ml）单宁酸（ml）胶体金（nm）45000342000445006412084701041016柠檬酸三钠法制备12-30nm胶体金(Frens,1973)取250ml三角瓶一个，加100ml双蒸水及1ml1%氯化金，加热沸腾；取不同量的1%柠檬酸钠参与上述溶液中。混匀，再坚持沸腾30min，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，那么颜色偏向紫色。29柠檬酸钠(ml) 胶体金(nm) 5 12 4 16 3 24 2.8 30 制备高质量胶体金的本卷须知〔1〕玻璃器皿必需彻底清洗，最好是经过硅化处置〔1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干〕的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后运用。否那么影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。〔2〕试剂配制必需坚持严厉的纯真，一切试剂都必需运用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜〔0.45µm〕过滤，以除去其中的聚合物和其它能够混入的杂质。〔3〕配制胶体金溶液的pH以中性〔pH7.2〕较好。〔4〕氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。〔5〕氯金酸配成1％水溶液在4℃可坚持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解，暂时不用的可以用1.5ml试管分装为1ml保管〔-20℃〕。30由于运用试剂质量及其它方面能够存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大小及一致性与实际值能够有偏向，因此，在制备完成后必需进展镜检。如出现粒子体积偏向太大，粒子凝聚，粒子边缘不明晰等问题，须重新制备。胶体金溶液最好保管在4℃冰箱中；也可保管在室温下，普通可保管1-2个月。但决不可保管在0℃以下，否那么金粒子发生凝聚。31蛋白-金复合体的制备32必需了解蛋白与胶体金耐久结合的物理及化学进程，仅仅把交联物揉合到一同，虽然本钱低廉且简易，却通常会导致聚集体的构成。一种好的交联物表现为蛋白吸附于金的外表上，与胶乳不同的是，蛋白是被动地吸附于交联物外表，因此不会出现共价结合。33普通以为胶体金粒子外表为一层AuCl2，因此，粒子外表带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，构成稳定悬浮的胶体金溶液。金颗粒外表可以包被一层生物大分子〔如蛋白〕来稳定和维护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一同。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值，这是因蛋白的净电荷取决于溶液的pH值，在pH=pI时为中性。由于在pH=pI时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子外表。但在实践的胶体金探针制备中，普通胶体金调整为pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易构成结实的结合物。假设胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，那么会聚集而失去结合才干。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。34蛋白经过以下机制于几秒之内吸附于金外表金粒子所带负电荷与蛋白内氨基酸〔如赖氨酸〕所带阳性电荷的最初的相互吸引蛋白经过某些氨基酸残基包括色氨酸与金粒子外表之间的疏水吸附作用蛋白中的半胱氨酸的硫基与金粒子间的配价结合35金颗粒大小的选择检测信号是由金颗粒聚集于测试线或控制线而出现的信号。这些粒子必需足够大到能被看见，粒子的尺寸越大，这些粒子聚集后就越容易被看见。随着粒子尺寸的增大，位阻景象又成了一个问题。此外，这些粒子的尺寸越大，它们在既定体积溶液中存在的数量越小。这种可见度的需求与位阻景象之间的矛盾景象阐明，对于大多数的免疫检测运用而言，最适的粒子大小是40nm。在某些情况下当位阻景象成为较大问题时〔如针对较小的抗原〕，20nm的粒子那么更为适宜；当希望出现更深颜色或当分子外表较低的曲率提高了抗原抗体分子间的交互作用，较大一点的粒子那么更为可取。应该由实验决议确定多少颗粒大小能带来高灵敏度、浅背风光和高稳定性。3637蛋白必需求经过前处置〔1〕去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进展。〔2〕使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标志的灵敏度和定量分析。〔3〕使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小〔30kD〕，构成的金-蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被以为影响金-蛋白复合体的灵敏度，特别是知蛋白的构造与活性中心的情况下，去除对活性武影响的构造部分是提高标志灵敏度，延伸金-蛋白复合体寿命〔防止凝集〕的有效方法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白〔如BSA，牛血清蛋白等〕结合后，能制备出稳定性更佳的金-蛋白复合体。3839抗体Antibody来源差别:鼠抗,兔抗和羊抗种类差别:单抗,多抗腹水的处置:饱和硫酸铵沉淀法特异性:亲和层析柱浓度:浓缩溶解液:不含盐,例如PB抗原抗体生物原料抗原Antigen偶联抗原物质:BSA,OVA等毒品检测来源:合成抗原待标志蛋白溶液的制备

将待标志蛋白预先对0.005Mol/LpH7.0NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100000g4℃离心1h，去除聚合物。40确定胶体金与蛋白结合的最正确pH值

对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同pH值得胶体金结合后，只需某一特定pH值可以构成结合最稳定的金-蛋白复合体。在高浓度电解质〔如NaCl〕作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜pH范围的宽窄大不一样。普通选择最小适宜pH值为最正确pH值。但有些金-蛋白复合体的实践情况并不完全如此，最稳定金-蛋白复合体并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。这里需求特别指出的是，运用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最正确pH也有一定变化。41由于胶体金溶液能够损坏pH计的电板，因此，在调理pH时，采用精细pH试纸测定为宜。由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必需留意，蛋白质溶液应绝对廓清无细小微粒，否那么应先用微孔滤膜或超速离心除去。普通情况下应防止磷酸根离子和硼酸根离子的存在，由于它们都可吸附于颗粒外表而减弱胶体金对蛋白质的吸附。42蛋白质最适用量的选择参与蛋白质的量缺乏以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉景象；而参与蛋白量到达或超越最低稳定量的各管仍坚持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标志蛋白质的最低用量，在实践任务中，可适当添加10％～20％。可以构成稳定金-蛋白复合体的蛋白的最小量。假设在制备金-蛋白复合体时参与太多的蛋白，不仅呵斥浪费，而且更为严重的是容易呵斥金-蛋白复合体凝聚，并严重影响标志活性。由于金-蛋白复合体溶液中的游离蛋白容易抢先与标志位点结合，起到“封锁〞〔Blocking〕作用，而标志蛋白标志不上。在标志位点希少、被标志物含量较少的情况下要特别留意。43胶体金标志蛋白的纯化超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标志蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/5