药品生物检定技术复习课件

第一章供试品溶液的配置1、药品生物检定的概念及“特殊反响〞例子2、标准品分类3、药品生物检定的任务4、供试品的配置生物检定〔Bioassay〕是利用生物体对药品的特殊反响来测定药品的有效性、平安性和研究药物量效关系。“特殊反响〞---量反响，质反响------微生物致死反响测定抗生素------小鼠热板法测定镇痛药标准品分为国际标准品，国家标准品，工作标准品如：联合国世界卫生组织生物检定委员会，丹麦哥本哈根血清所，伦敦国家医研所2006年5月4日起EDQM〔欧洲药品质量管理局〕将取代英国国家生物标准与检定所〔NIBSC〕的职能，负责WHO抗生素国际标准品的建立、贮藏与分发。中国国家标准品统一由国家药品生物制品检定所管理。工作标准品由个企业自行按需要制备。药品生物检定的任务药品效价测定---第六、十二、十三章有害物质检查---第十、十一、十四章微生物限度检查---第四、八章无菌检查---第五章配置操作的本卷须知配置实验器具的灭菌与消毒固体称量的本卷须知注意点容量瓶定容的本卷须知检查容量瓶的密闭性吸管的预洗移液管尾滴的处理

第六章抗生素效价的

微生物测定１.解释抗生素概念、了解抗生素的主要作用机制

２.表达抗生素的效价和单位及其表示方法

３.熟知抗生素效价检定操作流程与根本要求

４.测定原理。第一节概述一、抗生素的概念:抗生素主要是由微生物所产生的极微量便具有选择性地杀死或抑制它种生物或肿瘤、细胞生长的一类天然有机化合物。二、医药用抗生素的特点具备以下4个特点才能应用到临床。(1)有较大的差异毒力

是由抗生素的作用机制决定的,如青霉素类抗生素能抑制细菌细胞壁的合成，而对人与哺乳动物没有影响,因而该类抗生素具有明显的差异毒力。(2)抗菌活性强

抗菌活性的强弱常用最低抑菌浓度(MIC)来衡量，MIC值越小，表示活性越强。

(3)抗菌谱广即指各种抗生素所能抑制或杀灭微生物的范围，范围广谱者称为广谱抗生素，即对多种病原菌都有抑制和杀灭作用；范围窄的为窄谱抗生素，如青霉素主要抑制革兰阳性菌，多粘菌素只能抑制革兰阴性菌，而具有抗肿癌作用的抗生素那么称为抗肿瘤抗生素。(4)不产生副作用和不良反响良好的抗生素应对机体无毒性，不引起变态反响，不易使病原菌产生耐药性。〔一〕概述物理、化学法微生物法简便、快速，本身纯度不高，采用该法会引起偏差，因此只有在纯度较高情况下可采用原理和临床应用的要求相一致，直接反映出抗生素的疗效，且灵敏度较高，需用量较小，因此被广泛使用。微生物法依据抗生素最小抑菌浓度而设计的稀释法；根据不同浓度的抗生素对微生物生长速度的不同影响程度而设计的比浊法[?中国药典?称之为浊度法并收载]；有依据抗生素渗透到含敏感菌的琼脂培养基中产生抑菌圈而设计的管碟法(又称扩散法，杯碟法或垂直扩散法)；根据对微生物呼吸抑制程度而设计的呼吸度量法；根据对微生物代谢产物的影响而设计的快速法，对微生物体内酶系统产生影响的脱氢法。浊度法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的种方法。管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量(浓度)与抑菌圈的外表积或直径成正比〔二〕抑菌圈的形成

将不锈钢小管(俗称为牛津杯)放置在含敏感试验菌的琼脂培养基上，将抗生素溶液注入小钢管中，抗生素分子随溶剂向培养基内呈球面状放射状扩散。同时将培养基置入适宜试验菌生长的培养箱中，琼脂培养基中的试验菌开始生长。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度，随离开小钢管的距离增大而降低，离小钢管愈远，琼脂培养基中抗生素分子愈少，相应的抗生素浓度愈低。当抗生素分子扩散到一定时间，在小钢管周围形成一个能有效的抑制试验菌生长的范围，也就是通常所说的抑菌圈。抗生素溶液的浓度不同，抑菌圈的大小亦不同(图4－1)。按设计原理不同分

管碟法一剂量法〔标准曲线法〕二剂量法〔2·2法〕三剂量法〔3·3法〕管碟法分为三种方法一剂量法又称标准曲线法，常用于原料生产的过程监控、中间体或半成品检验；二剂量法是抗生素质量检验的常规方法；三剂量法主要用于标准品的标定。中国兽药典〔2005年版〕收载了二剂量法和三剂量法。第二节

抗生素的效价和单位

一、抗生素的效价和单位抗生素的含量用效价和单位表示。该词有时不加区别统称为效价单位。效价〔ｐotency〕－指检品的实际单位数与其标示量的比值。常表示为效价的百分数。效价是从比较检品与标准品的生物活性而得。在不同的微生物效价测定中，效价计算的公式见后述。单位〔unit,u〕单位是衡量抗生素有效成分的具体尺度。各种抗生素的单位含义不同，在习惯上根据它们的实际开展情况而定，抗生素效价单位的具体表示方法见后述。标准品与国际单位(internationalunit,iu)抗生素微生物测定用的标准品，除国内的新品种外，凡已制备国际标准品的品种，在制备国家标准品时，均与国际标准品比较而定出效价。

二、抗生素的效价单位的表示方法１、质量单位以抗生素的生物活性局部质量作单位，１微克〔ｕｇ〕＝１单位，１毫克＝１０００单位。２、类似质量单位以特定的纯粹抗生素盐类的质量作为１单位。如纯粹金霉素盐酸盐及四环素盐酸盐〔包括无生物活性的盐酸根在内〕１微克〔ｕｇ〕＝１单位，１毫克＝１０００个单位。这是根据国际使用习惯而来的。３、质量折算单位以特定的纯抗生素盐的质量为单位而加以折算。４、特定单位以特定的抗生素样品的某一质量定为一单位。第三节

管碟法测定操作1.试验用菌液、缓冲液、培养基的制备按药典规定进行制备。2.标准品与供试品溶液的制备按药典规定制备标准品与供试品上下不同浓度溶液。(见表4-3和4-11)。3.双碟的制备制备底层及含一定量试验菌的菌层，并安置小钢管。4.滴加药液到小钢管内将标准品、供试品溶液滴入相应的小钢管中。5.培养在恒温培养箱中培养至规定时间。6.测量抑菌圈可用手工测量或仪器测量。7.计算结果先进行可靠性测验,符合规定,再进行效价计算标准品的称量

→标准品的稀释→标准品溶液

供试品的称量

→供试品的稀释→供试品溶液

缓冲液的制备

培养基的制备→

底层20ml─→菌层5ml─→┌───平板的制备────┐

凝固后

凝固后

↓

↓

菌液的制备

加菌液

加小钢管--─┐─┐可靠性测验，计算结果

←──测量抑菌圈←─培

养

抗生素效价检定管碟法操作流程第三节

管碟法测定操作加陶瓦园盖T2S1S2T1二剂量法扩散现象：由球面扩散动力学公式表示相当于直线方程：y=bX+c抗生素总量的对数值与所形成抑菌圈直径的大小呈直线关系，来测定抗生素抗菌活性。1理论依据：2.影响因素?

Ⅰ超净工作台Ⅲ双碟Ⅱ抑菌圈测量仪Ⅴ钢管Ⅳ陶瓦盖Ⅵ恒温培养箱Ⅷ玻璃仪器Ⅸ游标卡尺Ⅹ缓冲液Ⅺ培养基Ⅻ试验菌Ⅶ灭菌刻度吸管3.仪器用具材料抑菌圈〔抗生素效价〕自动测量分析仪③菌悬液的制备⑦检定法④标准品溶液的制备⑤供试品溶液的制备⑥双碟的制备②灭菌缓冲溶液①培养基及其制备方法4.测定方法水1000ml磷酸二氢钾1.32g

磷酸氢二钾3.68g氯化钠3.sg酵母浸出粉3g

胨5g牛肉浸出粉1.5g葡萄糖1g培养基3号①培养基及其制备方法除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节P值使灭菌后为7．0～7．2，在115oC灭菌3分钟，即得。磷酸盐缓冲液〔PH6.0〕取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115oC灭菌30分钟，即得。磷酸盐缓冲液〔pH7.8〕取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115oC灭菌30分钟，即得。②灭菌缓冲液枯草芽抱杆菌悬液取枯草芽抱杆菌〔63501〕的普通琼脂斜面培养物，接种于盛有普通琼脂斜面培养基的培养瓶中，在35－37oC培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65oC加热30分钟，即得。短小芽抱杆菌悬液取短小芽抱杆菌〔63202〕的普通琼脂料面培养物，照上述方法制备，即得。③菌悬液的制备

标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照附表的规定进行稀释。

精密称〔或量〕取供试品适量，用各该药品项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照附表的规定稀释至与标准品相当的浓度。④标准品溶液的制备⑤供试品溶液的制备

取内径90mm、高16—17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48－50oC〔芽孢可至60℃〕，参加规定的试验菌悬液适量〔能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18－24mm。⑥双碟的制备二剂量法取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的上下两种浓度的供试品溶液，高、低浓度的剂距为2：1或4：1。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈直径〔或面积〕。⑦检定法供试品效价相当于标示量或估计效价的百分数=㏒-1[T1＋T2－S1－S2×I]×100T2＋S2－T1－S1⑧统计计算与结果判定S2=高浓度标准品溶液所致的各抑菌圈直径的总和，S1=低浓度标准品溶液所致的各抑菌圈直径的总和，T2=高浓度供试品溶液所致的各抑菌圈直径的总和，T1=低浓度供试品溶液所致的各抑菌圈直径的总和。I=高浓度与低浓度比值的对数。将此百分数乘以供试品估计效价的毫克单位数，即得供试品每lmg中所含的单位数。二、影响因素的控制1．直线斜率的控制斜率小，即抗生素浓度差异小，而抑菌圈的直径差异大，灵敏度的准确性高。2．直线截距的控制直线截距决定于C、D、T、H诸因素，其中D、T值一般相当稳定，所以C、H是决定截距的主要因素。如将培养基厚度H减小，截距也随之减小，抑菌圈增大。据此可设计薄层培养基，可大大提高检验的灵敏度

3．抑菌圈大小的控制抑菌圈的大小受L、H、C、D、T及A等诸因素的影响。抗生素总量M＝CV＝CAL，〔A为管底面积、L为高度、V为管内体积、C为抗生素浓度〕,可见抗生素浓度是影响抑菌圈大小的，假设C不变，那么r²随V而变化，那么L或A均影响抑菌圈大小。因此抗生素浓度应准确，包括称量、稀释均应准确，稀释用的仪器、容器均应标准。4．培养基的厚度H、试验菌敏感度C、扩散系数D的影响

H增大，r缩小；H减小，r增大。C常受加菌量及对抗生素耐药性等因素的影响而有所改变，从而影响r大小。T受细菌生长快慢的影响而引起r改变。D扩散快慢亦可使r改变，因此应注意选用敏感性的试验菌并保持其不变异，特别要防止染菌，制备菌层时含菌浓度要适宜，可采用预试验来确定；向小钢管内滴加标准溶液和供试溶液时要交叉进行，以免偏向。

5.剂量反响直线范围控制直线范围在以下情况下会缩短：管径小、装量小；浓度低；因培养基或试验菌吸附或破坏抗生素等因素使小钢管中抗生素量下降，导致直线范围缩短，常使呈弧形。为此可用调整缓冲液的pH值，使抗生素稳定；调整培养基pH值；调整培养基的处方及除去杂质；选用更为敏感的试验菌加以控制。6.抑菌圈圆整及清晰度的控制抑菌圈常有破裂不圆，甚至无圈现象。这些情况的产生主要是由于向小钢管加抗生素溶液时有溅出或漏出；有时也可能因双碟或小钢管残留或污染有抗生素而造成的。如果污染杂菌或因菌层培养基温度过高，试验菌被烫死，均会使抑菌圈不圆整或破裂。(2)抗生素的培养基内抗散系数不一所引起抗生素的培养基内抗散系数不一，如混有几种类型的抗生素、抗生素受缓冲液或受培养基内的杂质影响，或使其形成某种化合物，致使抗生素浓度总量发生变化。因此对培养基的原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及琼脂等的选用极为重要。这些都可影响仰菌圈的大小和清晰度。在某些情况下出现抑菌圈边缘模糊、类似锯齿状或双圈等现象，主要由以下因素所引起：

(1)试验菌培养物不纯所引起当试验菌培养物不纯，几种菌株，如菌种中杂有耐药性菌，使C含有C，、C，，、C，，，等差异含有一同敏感度的，致使扩散系数紊乱。其次菌种中有不同生产时间的菌体，以致有不同的Ｔ值，这些都能使抑菌圈边缘不清晰。(3)小钢管内的抗生素浓度不断下降所引起当试验菌能吸附或破坏抗生素时，这种情况就更加严重，此时可出现双圈现象。

(4)不适当地延长培养时间所引起由于某些抗生素的抑菌圈边缘的菌群只是被抑制，当延长培养时限后，菌量增加，使抗生素敏感度降低。抑菌圈边缘菌群继续繁殖，导致抑菌圈变小或边缘模糊不清不整齐，如测定制霉菌素时，培养时间长，其抑菌圈边缘就不清晰或不整齐。要控制培养时限，使抗生素培养基的浓度，恰当抑制实验菌，而在抑菌圈边缘的浓度能刺激试验菌生长，就能形成清晰的抑菌圈。此外，对抗生素标准品和供试品同质的要求至为重要。因为效价测定设计是假定二者剂量反响直线是相互平行除操作影响外，无论是标准品中或供试品中假设有其他抗菌性物质或影响抗菌活性的物质〔加强或拮抗〕，均可使二者剂量反响直线不平行，对此必须注意。如供试品四环素制剂中含有维生素C时，在标准品中也应参加相应的维生素C，以保持标准品供试品的同质性，这样检验结果才是可行的，也才能准确。三、抗生素操作要求〔1〕防止抗生素污染由于管碟法是微量的微生物分析法，故称量稀释除应满足用容量分析及仪器分析进行定量分析的一般要求外，还应注意效价测定试验室内防止抗生素污染。效价测定滴加钢管的操作室内，地面，水平操作台，钢管放置器，钢管，墙壁以及各项玻璃用具，工作服，工作人员双手等，都要防止被抗生素污染。即使有微量抗生素的污染，往往使试验结果混乱。微量的抗生素还可以附着在尘埃上，随着空气流动散落在双碟培养基平板，钢管，钢管放置器上，有时可能是使抑菌圈破裂的原因。因此，要防止将抗生素溶液滴在地上或工作台上，如被污染时应及时清洁。在配制培养基或缓冲液时，亦应严防被抗生素污染。〔2〕操作次数序安排上的误差在一剂量法制备标准曲线时，双碟数量较多，滴加抗生素溶液至钢管的时间，各个双碟的时间根本一致。如滴加8组稀释度双碟，可从中心浓度组开始向高，低二端交叉滴加。如稀释度为C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7及C8，滴加次序可C4，C5，C3，C6，C2，C7，C1及C8。这样，可减少各组间抗生素扩散时间及试验菌生长时间的差异。尤以枯草杆菌在室温较高时，这种影响更为明显。此外，标准品与供试品的称量，应在相近的时间内称取，稀释后的溶液尽量在相同的条件下放置，并使放置的时间也相同，以减少误差。三剂量法

所谓三剂量法是指用高、中、低三种剂量，在同一条件下比较抗生素标准品与供试品溶液产生的抑菌圈大小，以求得供试品效价的方法。三剂量比二剂量多一种抗生素剂量，能增加结果的准确程度。在选用三剂量法时，要求剂量的大小一定要在直线关系的范围内。在测定标准品的准确效价时通常选用三剂量法.一、效价计算公式PT=lg-1[0.1292(T3+T2+T1-S3-S2-S1)/(S3+T3-S1-T1)]×100％(4－10)二、测定方法按?中国药典?(2005年版)规定制备试验菌悬液，培养基，并配制抗生素标准品及检品的高、中、低三种剂量的溶液，三种溶液的剂距为1:0.8，标准品中剂量的抑菌圈直径为15～18mm。选用的双碟不得少于6个，在每一双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴加高浓度、中浓度、及低浓度的标准品溶液，其余3个小钢管中分别滴加相应的高、中、低三种浓度的供试品溶液。经培养后，精密量取各抑菌圈直径，经可靠性测定后，符合规定，按效价计算公式计算效价。如不符合规定，予以重试。三、效价计算和误差分析可参考?中国药典?(2005年版)附录内容的例题。一剂量法一、设计原理与计算公式本法系用效价的标准品溶液制备出标准曲线，并在同样条件下测出供试品溶液所致抑菌圈直径的平均值后，再求出其与标准品溶液所致抑菌圈直径平均值之差，即可在标准曲线上直接得供试品溶液的浓度，换算出效价，故称标准曲线法。由于检定标准品和供试品都采用一个剂量，故也称一剂量法。由公式(4－2)：lgM=(1/9.21DT)r2＋lg(C.4πDTH)可知，抗生素总量的多少受最低抑菌浓度(C)培养基厚度(H)扩散系数(D)和细菌生长时间的影响；同时由公式(4－1)r2=4DT［lnM-lnC-ln(4πDTH)］也可看出抑菌圈的大小也受C，H，D，T的影响。所以在效价测定时应消除这些影响，才能得到准确的结果。消除这些影响，可用相对效价设计法，即用标准品同时作对照测定的方法。其计算方法如下：设标准品的抑菌圈直径为S1：标准品的总量为M。供试品的抑菌圈直径为T1:供试品的总量为M’。那么lgM=(1/9.21DT)S21+lg(C.4πDTH)(4－11)lgM’=(1/9.21DT)T21+lg(C.4πDTH)(4－12)因lg(C.4DTH)为截距，在同一双碟上其数值是相等的，因此两式相减时可以消掉并得到lgM’/M=(1/9.21DT)(T21-S21)(4－13)lgM’/M为供试品与标准品的效价比对数，令θ=M’/M那么：lgθ=(1/9.21DT)(T21-S21)(4－14)因(1/9.21DT)直线的斜率，故供试品与标准品的效价比对数即等于斜率乘供品的抑菌圈直径的平方与标准品抑菌圈直平方之差。此即管碟法的标准曲线法的根底。根据上述原理。可知效价与抑菌圈半径的(或直径的)平方成直线关系，其直线方程式为lgY＝aX＋b。当供试品与标准品对照测定时，b可消掉，成为lgθ＝a〔X，－X〕，也即效价的对数等于斜率供试品与标准品的抑菌圈直径之差数。标准曲线测定效价便以根底。即:lg效价=(斜率)×(供试品抑菌直径-标准品抑菌圈直径)(4－15)在上式中只要知道斜率，那么可求出lg效价。为了消除测定碟间的差异，在每一双碟的加菌培养基上置6枚不锈钢小管〔简称小钢管〕，间隔的3枚内中参加标准品的某一特定浓度Ck，它们所产生的抑菌圈直径平均值为，另3枚内参加标准品的中心浓度Co，它们所产生的抑菌圈直径平均值为0。令fk=yk－y0(4－16)这样采用的自身对照方法，当某一碟的条件使抑菌圈偏大时，k和0都将按相似的程度偏大，反之亦然。因此fk在碟间的差异必然小于k在碟间的差异。所以f值亦应与抗生素浓度的对数值呈直线的函数关系。即f=ax+b，据此可只制备标准曲线。二、标准曲线制定与测定方法1.标准曲线制定①中心浓度的选择：根据各种抗生素的对数浓度〔剂量〕一抑菌圈〔反响〕拉关系的直线范围内，先选择一个中心浓度Co，浓度所致的抑菌直径大小适合在16～17.5mm，并用容量瓶稀释制备溶液。一般均取整数。②各剂量按等比级数稀释，剂距一般为三种：1：0.81：0.881：0.85。当中心浓度和剂距确定了以后，应再算出中心剂量邻近的上下2个浓度C0+1及C0-1。例如：Co=10u/ml，剂距ｒ为1:0.8；∵r=(C0+1)/(C0-1)=1/0.8，∴C0-1=0.8(C0+1)。又C0+1/C0=C0/C0-1，∴C0+1=10­­2/C0～1，经推导，C0-1=8.94U/mlC0+1=11.18U/ml，其它各量按等比级数分别计算即得。③从试验结果求得各点位置，在半对数座标纸上，将各点连接得一直线，直线应通过中心点，由各剂距量点连成的标准直线应有70％的点在直线上。④试验器材准备及操作见本章第四节。现以链霉素效价测定为例加以说明如下：精密称取链霉素标准品，用磷酸盐缓冲液稀释成各种浓度Ck(k1-K8)，见表4－6。同时配制标准品中心浓度C01.0U/ml，剂间比1:0.88，取备妥的双碟24只，分为8组每组3只。每组各碟内间隔的3枚小钢管内分别滴满标准品Ｃk1-8，即0.64……1.56U／ml溶液

；另3枚小钢管内均滴满标准品的中心浓度Co即1U/ml溶液。如图4－6经培养16～18h后，逐一测量每一个抑菌圈直径。分别求得每组3个双碟中心浓度Co所致的抑菌圈直径平均值Yo及C1～C8所致抑菌圈直径的平均值，即k(Ck=1-8)。令fk=k－o，分别计算Fk值，8组双碟可得出的F1-8的8个反响参数以fk值为横坐标，以相应的抗生素浓度对数为纵坐标，在方纸上标点：或以fk值为横坐标，相应抗生素剂量Ck为纵坐标，在双周半对数图纸上标点，将各点联结即成标准曲线，见图4－7。或经计算，得出回归直线方程式。3.供试品效价测定：

取标准品制备中心浓度的标准液，并取供试品，预估效价后用缓冲液稀释到与标准品的中心浓度相同的供试液。取备妥的放置6枚小钢管的双碟，一般不少于3个，在每一双碟中，间隔的3枚小钢管中分别滴满中心点浓度的标准液，另3枚小钢管中滴满供试液。在规定条件培养后测量各抑菌圈的直径。分别求得标准液抑菌圈直径平均值0和供试液抑菌圈直径的平均值yk，算出yk-y0的差数(fk)。据此在标准曲线上读取供试液的浓度，即可转换成供试品所含效价U/ml，亦可以代入直线回归方程式，算出供试品的效价。三、统计处理公式1.标准曲线的直线回归在用一剂量法效价测定中，制备的标准曲线，从理论上是要使剂量(lgM)和反响(f)所构成的点在一条直线上，但实际上由于生物差异等因素的存在，各点终归有些偏离于这条直线，直线回归就是求出最适合于这些点的直线的方法。直线回归方程式：y^＝y＋b〔x-x〕(4-17)式中b为回归系数,即回归直线的斜率。当x增减1个单位时,y平均增减b个单位；由于这个斜率是由各点与(x、y^)构成斜率的平均的斜率，在以这平均斜率〔即回归系数b〕来计算供试品的效价，这就克服了人为绘制直线存在的缺点，使实验正确可靠。求b公式如下：b=〔∑xy-x∑y〕/〔∑x2-x∑x〕(4－18)2.β的可信限有些实验数据即使不是直线关系，也可能按直线回归的方法求出一条直线来。此时回归系数已无法说明这些实验数据是否真正的呈直线关系。为检验实验各点符合一条直线的密切程度如何，可应用直线性测验方法，即根据实验求得b值，估计总体β的可信限来考核，以便对实验有个客观的分析。y^＝y＋b〔x-x〕(4－19)Sy.x=∑(y-y^)/(n-2)(4－20)Sb=Sy•x/∑(x-x〕2(x-x)(4－21)β=b+t0.05•Sb(4－22)式中y^:由回归方程式求出的y值，被称为估计y值，其符号y^用表示。Sy.x:误差项的标准差Sb:回归系数的标准误β:总体回归系数t0.05的自由度应为n-2，因y^值受y及b两个统计量限制量的限制3.一剂量法的效价计算

可用下式:lgR=(yＴ-y8)/b(4－23)PT=R．AT

(4－24)

图4－8：一剂量法测定统计结果图美国药典一剂量法YJF-Excel统计软件的统计结果表

难题解答1.在配制标准品或供试品溶液时如何进行样品称量的计算?答:方法一按称样量的计算公式：W=V·C／P进行计算。公式中W为：需称取标准品或供试品的重量〔mg〕；V为：溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积量〔ml〕；C为：标准品或供试品浓溶液的浓度〔U/ml或μg/ml〕；P为：标准品的纯度〔单位数〕或供试品的估计效价(U/ml或μg/mg)。如课本例题：W=50×1000／683＝73．206mg方法二工厂多采用该法称取的样量mg数×标示的单位数÷1000＝加溶液的ml数＝1000u／ml如标示单位为628u／mg的抗生素，如称取50mg，那么50×628÷1000＝31．4ml＝1000u／ml的母液。计算练习题1．配制含新霉素标准品溶液1000U/ml的母液50ml，应称取多少mg标准品(标准品单位为683U/mg)？又如何配制成高剂量(20U/ml)、低剂量(10U/ml)两种浓度的效价测定液？配制时应注意哪些问题？2．某批新霉素原料的估计单位为600U/mg，按药典要求配制成高剂量(20U/ml)、低剂量(10U/ml)两种浓度的效价测定液，该如何配制？测定

方法

?中国药典?规定：供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。本节将详细介绍这两种方法的操作与有关原理。凝胶法

光度测定法

浊度法

显色基质法

一、内毒素与热原的关系二、开展简况1991年USP22版第5增补版公布了185种药品用细菌内毒素检查。第23版那么达471多种,到1999年24版高达670余种,而用家兔热原检查仅有20多种。2000年国际调和委员会使美国药典〔USP〕、欧洲药典〔EP〕和日本药局方〔JP〕达成?BET的国际调和案?，统一的BET已收栽于USPXXⅣ版NF19的第二增补本中，并于2001年1月1日生效。随后USPXXⅤ、USPXXⅥ、USPXXⅤⅡ均正式收栽。1987年欧洲药典收载了?细菌内毒素检查方法?，1998年收载品种已达100多种。1989年英国药典〔JP〕收载了该法，到1997年有40余种用该法检查，2000版收载了147种。1991年日本药局方也收载了该法，14药局方也超过200多种。2.我国的研究应用概况：1978年我国药检系统开始研究鲎试验法。1983年，开始组织了鲎试验标准化的研究，确立了生物活性效价单位(内毒素单位EU)表示的我国内毒素参考标准品；确定了以此标准品10EU/Kg为静脉注射药品的致热阈值(K)。1988年药典委员会指导制定了?细菌内毒素检查法?和鲎试剂标准，作为4种剂型注射液热原检查初试方法，10月在全国试行。1991年9月转为正式部标准。1995年版中国药典收载，规定细菌内素检查品种13个。2000年版?中国药典?〔二部〕做了修订，收载了?细菌内素检查法应用原那么?，检查品种69种。?中国药典?(2005年版)再次做了重大修订,〔一部〕〔二部〕〔三部〕均收载了?细菌内素检查法?，增修订检查品种达112种，其中〔二部〕就收载检查品种186种；〔三部〕收载检查品种19种。三、开展趋势与特点1．国家药典收载成为开展的必然趋势2．内毒素检查法取代热原检查成为必然的方法

3．走向统一的细菌内毒素检查法USP、EP和JP自2001年实现了统一。4.应用的方法越来越多

(1)方法多样化〔2〕方法自动化〔3〕方法微量化5．应用的范围越来越广四、根本概念和反响原理概念:本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。凝胶法光度测定法浊度法和显色基质法供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。细菌内毒素的量用内毒素单位〔EU〕表示。细菌内毒素检查法2.内毒素和鲎试剂的反响机理:以简式表示如下：内毒素↓C因子─→活化因子旁路↓ＬＡＬ-ＲＭ或Ｂ因子─→活化因子β-Ｄ-葡聚糖↓↓凝固酶原─→凝固酶活化Ｇ因子←←Ｇ因子〔激活〕│∕↓↙凝固蛋白原───→凝固蛋白〔酶解〕│交联酶│(聚合)凝胶凝胶如下图该反响出现凝胶为阳性；假设无出现或凝胶脱落那么为阴性3.细菌内毒素国家标准品(RSE)系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素。用于标定细菌内毒素工作标准品(CSE)的效价和标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度。细菌内毒素工作标准品(CSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其重量的相当效价。每1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU。细菌内毒素工作标准品用于鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。4.细菌内毒素检查用水(BET)是细菌内毒素检查法专用水〔本节所指的水均是该专用水〕。凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度法测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。5.

鲎试剂与鲎试剂灵敏度鲎试剂的种类鲎试剂〔LAL〕中国鲎试剂〔TAL〕园尾鲎试剂〔CAL〕美国生产中国与日本生产检查方法凝胶法鲎试剂定量法鲎试剂反响程度普通鲎试剂特殊性鲎试剂〔3〕鲎试剂规格是多少，就用多少细菌内毒素检查用水复溶试剂使用，如规格是0．5ml的试剂，就用0．5ml细菌内毒素检查用水复溶。〔4〕鲎试剂灵敏度是指在细菌内毒素检查的条件下(规定条件下)能检测出内毒素标准溶液或供品溶液中的最低内毒素浓度。(即能与鲎试剂发生阳性反响的最低浓度)。以EU/ml表示。如λ=0.5EU/ml；0.25EU/ml等。6.细菌内毒素限值(Ｌ):指哺乳动物(或人)对药品中细菌内毒素所能耐受的不致于引起热原反响的某定量限值的量单位称之。为保证用药平安。给每一种药物规定了相应的限值,用L表示。只要低于该限值,按规定给药途径用药就是平安的。在进行检查时,首先要知道该品种的L值。确定药品品种L值的方法:１.在药典正文中查出:各国药典规定作细菌内毒素检查项的品种，都可在药典正文中查到相应的L值。如?中国药典?〔2005年版〕〔二部〕规定了186种注射剂的L值,〔三部〕规定了19种注射剂的L值;USPXXIV版规定了670种注射剂的L值。如：18-AAL值确实定:每小时人的公斤体重最大注射剂量是10ml(大输液一般是10ml),L=5ＥＵ/ml／10ml=０.５EU/ml

２.根据人的最大用药剂量计算而得:按公式L=K/M确定。式中L：供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml,EU／mg或EU／u表示；K：按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时接受额定最大内毒素剂量，以Eu〔kg．h〕。一般注射剂：K=5EU/〔kg·h〕；放射性药品注射：K=2.5EU/〔kg.h〕；鞘内用注射剂：K=0.2Eu/〔kg.h〕。M：为人体每公斤体重每小时最大用药剂量，以ml〔kg.h〕,mg/(kg.h)或u〔kg.h〕表示，中国人均体重按60kg计算。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需要说明理由。7.MVD〔最大有效稀释倍数〕(MVD)按下式计算：MVD＝CL／λ式中L为细菌内毒素的限值。C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，那么C等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，C的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，那么MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度〔EU/ml〕，或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。8．供试品溶液的制备

某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液〔或其稀释液〕的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。(一)检查程序：

实验试剂、仪器及用具等的准备

确定药品的细菌内毒素限值L

选择鲎试剂的灵敏度λ

计算供试品的最大有效稀释MVD或最低有效浓度MVC

鲎试剂的灵敏度复核

药品与鲎试剂相容性的初筛试验〔无干扰浓度初筛〕供试品的干扰试验的验证〔正式干扰试验〕供试品日常的内毒素限量检查(二)试验的准备工作与材料鲎试剂细菌内毒素检查用水标准内毒素旋涡混合器与细菌内毒素检查仪(凝胶法〕

旋涡混合器TAL－40型试管恒温仪

〔三〕确定药品的细菌内毒素限值〔L值〕见前述。

〔四〕选择鲎试剂的灵敏度λ

〔五〕计算供试品的最大有效稀释MVD或最低有效浓度MVC具体步骤

1.稀释标准内毒素

2.灵敏度复核的操作步骤

3.灵敏度复核实验数据的处理

〔六〕鲎试剂灵敏度复核?中国药典?规定当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。由此可见，进行复核的目的更重要的是对试剂、检测者的操作、环境条件、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。1.稀释标准内毒素

加细菌内毒素检查用水复溶

封口膜封闭安瓶口

用水稀释成2λ、1λ、l／2λ、1/4λ浓度的系列溶液，即0．12、0.06、0.03、0.015EU／ml浓度的系列溶液。灵敏度复核试验的具体步骤

稀释标准内毒素步骤如下:〔符号E20表示浓度为20EU/ml的内毒素溶液，其余类推〕：Ｅ２0

0.4mlE20混合30秒1.6ml水

0.9mlE2.0E2.0混合30秒0.9ml0.9mlE1.0混合30秒0.9ml1.8mlE0.25混合30秒1.8mlE0.125【本卷须知】稀释过程每一步骤所用的移液器具不能交叉混用！1.8mlE0.5混合30秒1.8ml2．灵敏度复核操作

使用λ=0.5EU/ml的鲎试剂进行复核。取鲎试剂先消毒处理、断开瓶颈部后、放入反响板孔中如以下图排列：〔NC表示阴性对照〕—————————————————————Ｅ2λＥ1.0λE0.5λE0.25λ〔EU/ｍl〕1.00.50.250.125NC—————————————————————1＊●●●●●鲎2＊●●●●●试3＊●●●●剂4＊●●●●先加：然后再加：0.1ml0.1ml

0.1ml

0.1ml

相应λ的标准内毒素Ｅ２λＥλE0。5λE0。25λ保温37℃1h，然后观察结果0.１ml0.1ml0.1ml0.1ml0.2ml水复溶鲎试剂水+水+水+水+水实验结果判断：将试管缓慢翻转“180０〞，假设管内凝胶显示坚实不变形为阳性，记录为“＋〞〔阳性〕；假设无凝胶出现，或虽有凝胶但不能保持完整，从管壁滑脱，均判为阴性，记录为“－〞〔阴性〕。实验结果判断返回结果判断:

如标准溶液最大浓度2.0λ的4管均为阳性，最低浓度0.25λ的4管均为阴性，阴性对照(NC)均为阴性，可按下式计算鲎试剂灵敏度测定值(λc)。ΣXλc＝lg-1[───]4式中X为反响终点浓度的对数值〔lg〕。反响终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ～2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。3．灵敏度复核实验数据的处理

按下式计算鲎试剂灵敏度复核值〔λc〕：ΣXλc＝Lg－１[——]４式中X为反响终点内毒素浓度的对数值。【计算举例】反响结果如下表：———————————————————————————————————(EU/ml)1.00.50.250.125NC反响终点Ｘ———————————————————————————————————l＃十十十一一2＃十十一一一3＃十十一一一4＃十十一一一————————————————————————————————————0.250.50.50.5-0.602-0.301-0.301-0.301注：凡只要各λ中的任何一管出现了+，该反响值对应的λ值即为该反响浓度的反响终点值。根据以下方式计算λc：

ΣXλc＝Ｌg－１————４(-0.602)+(-0.301)+(-0.301)+(-0.301)＝Ｌg－１———————————————————————————————４＝Lg‑1(-0.376)＝0．42Eu／ｍl即灵敏度复核值λｃ＝0.42EU／ml。由于0.5λ＜λｃ＜2λ，本批鲎试剂的灵敏度标示值正确，应按标示值λ=0.5EU／ml使用。假设复核的结果不是内毒素标准溶液最大浓度〔2.0λ〕的4管全阳性，最小浓度(0.25λ)4管全阴性，本批鲎试剂不能使用，须查找原因。可能是灵敏度标示不准确，或是内毒素效价标本不准确，或是操作不当的原因导致,应重试。假设复核时阴性对照(ＮＣ)均为阳性,试验无效,应重试。返回判断鲎试剂灵敏度复核试验录像播放鲎返回我国药检系统研究鲎试验法返回1995年版中国药返回2000年版?中国药典?将试管缓慢翻转180０返回(七)供试品干扰试验1.干扰试验的目的是判断检品在某种浓度状态下是否适合做细菌内毒素检查,这样的判断还包括以下条件的改变是否对细菌内毒素检查有影响：〔l〕鲎试剂来源的改变；〔2〕鲎试剂制备工艺的改变；〔3〕检品生产工艺，配方，成分的改变；〔4〕检品关键成分来源的改变；〔5〕鲎试剂批号的改变。因某些药品对鲎试剂的凝集反响可能有抑制或增强作用,分别使试验得出假阴性或阳性的结果，因此在检查前首先验证样品是否对试验有干扰作用。故又称为抑制或增强试验。往往在正式进行干扰试验检查前先进行无干扰浓度筛选试验。2.无干扰浓度筛选试验方法在正式进行干扰试验前可先做一次无干扰浓度筛选试验,用以确定无干扰浓度。下面以清开灵检品所示表达无干扰浓度筛选试验方法。(1)样品的等倍稀释设清开灵检品为S，其内毒素限值L＝1EU／ml，〔根据某厂内控标准而订，假设根据人用最大剂量剂量计算应为K／M＝5．0EU／ml／［40ml／60kg］＝7．5EU／ml〕。使用鲎试剂的灵敏度为λ=0．06EU／ml，由此得到最大有效稀释MVD＝Ｌ/λ＝1／0．06＝16(倍)。以16倍为基准作一系列不同倍数的稀释，进行无干扰浓度检查试验0.2ml原液0.9ml—————→混合30秒(16倍)——→混合30秒(32倍)3.0ml水0.9ml水0.9ml0.9ml———→混合30秒(64倍)———→混合30秒(128倍)0.9ml0.9ml0.9ml———→混合30秒(256)0.9ml(2)制备Es〔标准内毒素〕系列用BET水稀释内毒素工作标准品，方法与鲎试剂灵敏度复核相同，得到一个系列的2λ、0．5λ、0．25λ、0．125λ内毒素水溶液〔E０.１２，E０.０６，E０.０３，E０.０１5，〕这个系列我们称为Es系列。(3)按表5－5所示加样操作：

表5－5：无干扰浓度筛选试验加样图

163264128PCNCNPC管ＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯ0.1ml水0.1ml水0.1ml水0.1ml水0.1ml水0．2ml水

＋＋＋＋＋

0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlE２λPPC管ＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯＯ0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1ml水0．2ml水

＋＋＋＋＋

0.1mlE２λ0.1mlE２λ0.1mlE２λ0.1mlE2λ0.1mlE２λ

NPC管为〔-〕，PC管为〔＋〕，NC管为〔－〕的情况下,假设PPC低稀释倍数管为〔-〕,高稀释倍数管均为〔＋〕时,说明出现阳性的该浓度检品无干扰,试验结果成立,可正式以该浓度进行干扰试验加以确证，如表5－6所示。表5-6：清开灵检品无干扰浓度筛选试验结果λ=0.5EU/ml163264128PCNCNPC●●●●●●●●●●●●一一一一一一一一＋＋一一PPC●●●●●●●●●●一一＋＋＋＋＋＋＋＋图5－6显示：清开灵检品在16倍时有干扰〔PPC阴性〕，而在32倍时无干扰〔PPC开始出现阳性〕。假设PC管为〔－〕,或NC管为〔＋〕任一现象时，试验无效，须分析原因。或PPC管全为〔-〕或全〔＋〕现象时，须分析原因。3．干扰试验确证取检品SＭＶＤ来〔SＭＶＤ32经无干扰浓度筛选试验证实的浓度〕进行确证。(1)将检品稀释成SＭＶＤ32,然后代替鲎试剂复溶液来溶解鲎试剂(2)制备E系列〔标准内毒素〕：(3)取鲎试剂分别用检品SＭＶＤ复溶后与上述内毒素系列(Ｅ系列)反响，方法与灵敏度复核相同。而阴性对照(NC)是每管加0．2ml的复溶液。如表5-7所示。表5-7：干扰试验确证图

管2λλ0.5λ0.25λPCNC1＊

●●●●●●2＊

●●●●●●3＊●●●●4＊

●●●●

0.1mlSＭＶＤ水0.1mlSＭＶＤ水0.1mlSＭＶＤ水0.1mlSＭＶＤ水0.1ml水0.2ml水

+++++0.1mlE２λ0.1mlEλλλ0.1mlSMVD假设干扰试验结果PC全阳性和ＮＣ全阴性，同时内毒素最大浓度〔2λ〕4管全阳性，最小浓度(0．25λ)4管全阴性，本次试验该样品SＭＶＤ为无干扰作用；假设内毒素最大浓度〔2λ〕4管和最小浓度0．25(λ)4管全阴性，本次试验为有干扰。假设PC全阴性和ＮＣ全阳性，试验无效,须查找原因。可能是操作不当等的原因导致,应重试。试验的结果将得到两个灵敏度值。由于E系列的试验与鲎试剂的灵敏度复核试验完全相同，因此用同一符号λc表示灵敏度值；用λs表示E／S系列试验的灵敏度值。4．试验中各种对照的作用与意义〔1〕PC(阳性对照)的作用在于确证检查时所用的鲎试剂对内毒素具有必需的最低限度的生物活性。〔2〕NC(阴性对照)的作用在于防止试剂或器具自身的污染影响检查结果的准确性。〔3〕NPC(阴性产品对照〕的作用是防止检查出现假阳性,假设出现阴性对照管阴性，说明供试品在MVD浓度状态下对细菌内毒素检查无干扰〔抑制作用〕,试验正确。〔4〕PPC(阳性产品对照)的作用是防止检查出现假阴性的一个简单而十分有效的方法。它实际上是做了干扰试验的抑制局部，相当于半个干扰试验。PPC结果应阳性,假设出现PC管阳性，但PPC管阴性的结果，说明供试品在MVD浓度状态下对细菌内毒素检查有干扰〔抑制作用〕，虽然S1及S2管阴性，并不能完全证实供试品是合格产品，此种阴性结果可能是假阴性。出现这情况，需要对供试品作消除干扰的处理。通常消除于扰最简单有效的方法是改用更高灵敏度〔即λ值更小〕的鲎试剂，对供试品作更大倍数的稀释后再作检查。5．PC或NC结果异常的原因分析〔1〕PC结果出现〔-〕可能是由下述原因造成：内毒素工作品效价标示不准确或效价衰退或失效；稀释内毒素没有使用旋涡混合器或稀释操作不当；鲎试剂效价标示不准确或效价衰退或失效；反响试管放入水浴保温前试管中内容物没有摇匀。〔2〕NC结果出现〔＋〕可能是由下述原因造成：鲎试剂或水污染；实验器具污染；实验过程操作不当污染。(八〕检品日常的内毒素限量检查面仍以清开灵为例说明日常内毒素检查的方法及操作步骤：设：检品为S，L＝1.0EU／ml，选用规格为0.06EU／支，λ=0.06EU／ml的鲎试剂，MVD＝16〔倍〕，使用的内毒素工作标准品效价为10EU／支。参数λ及MVD已经过预试验验证。(1)取内毒素工作品1支，用水把它稀释成2λ浓度的内毒素溶液，即E０.１２。其操作参照前述灵敏度的复验。(2)取检品S，把它稀释成SMVD0.9ml0．2mlS＋3．0ml水—→SMVD16——→SMVD320.9ml(3)取鲎试剂(0.1ml/支)10支，其中4支分别标记S1,S2〔样品检查管〕，2支标记PC管,2支标记PPC管〕,2支标记NC管，然后插入试管架中，如表5－8所示，并按表5－8所示加样液。表5-8:检品日常的内毒素限量检查加样液示意图S1S2PCPPCNC●●●●●●●●●●0.1ml水0.1ml水0.1ml水0.1mlSMVD0.2ml水++++0.1mlSMVD0.1mlSMVD0.1mlE２λ0.1mlE２λ(4)封闭管口，摇匀，放入37±1℃恒温水浴保温60±2分钟，取出观察结果，记录结果。观察结果的方法如前述灵敏度复核试验。(5)检查结果的判断及处理在PC管为〔＋〕，PPC管为〔＋〕，NC管为〔－〕的情况下，假设2支S管均为〔＋〕，说明检品中的内毒素含量等于或大于规定限值，不合格；假设2支S管均〔－〕，说明检品中的内毒素含量小于规定限值，合格；假设2支S管中1管为〔＋〕，应按上述方法进行复试，取4支S管复试，假设所有4支平行管均为阴性，判供试品符合规定；否那么判供试品不符合规定。假设PC管为〔－〕,或PPC管为〔-〕，或NC管为〔＋〕任一现象时，试验无效，须分析原因。假设出现阳性对照管〔PC〕阳性，但阳性产品对照管〔PPC〕阴性的结果，说明供试品在MVD浓度状态下对细菌内毒素检查有干扰〔抑制作用〕，虽然S1及S2管阴性，并不能完全证实供试品是合格产品，此种阴性结果可能是假阴性。出现这情况，需要对供试品作消除干扰的处理。通常消除干扰最简单有效的方法是改用更高灵敏度〔即λ值更小〕的鲎试剂，对供试品作更大倍数的稀释后再作检查。第十三章生物活性检定一、生物测定的特点：

1.生物差异性大

2.实验误差大实验结果一般不及理化检验准确，实验误差通常在10～20％之间。甚至更大。

3.实验周期长，人力、物力消耗大，计算较繁

二、减少生物差异性的方法与措施

1.从实践和理论上了解各被试物对所用动物的生物反响差异性的规律2.调整样本的大小

3.对供试用动物进行条件因素的限制

4.研究各种实验方法的反响类型5.用生物统计方法提高实验的可靠性

三、生物反响类型(一)量反响当一定剂量的药物作用于生物体时，所引起的反响是可以计量大小的(观察药物反响的程度，可以用数字来表示其大小)。如器官长度的伸缩、血压的上下、器官重量的增减，抑菌圈直径的大小、凝血时间的长短等。(二)质反响当一定剂量的药物注入动物体内后，观察某一反响或反响的某一程度出现与否(只出现正负反响两种情况，而无程度之别，如死或不死、惊厥或不惊厥)，所引起的反响只有质的变化，即此类反响只可计数而不能用定量的方法表示个体反响程度。不少药物可选用不同类型的反响指标来进行生物测定。如胰岛素效价测定可以选用小鼠惊厥法，又可选用血糖降低法等；在选用反响指标时，应考虑反响的专属性及检定结果的精密度，一般要注意以下几点：(1)同质反响的剂量范围要宽生物测定必须在同质反响根底上进行，而药物同质反响一般都有一定的剂量范围，超出了一定的剂量范围，反响性质可能发生变化。(2)同剂量各次反响的差异要小即指标的重现性要好，此时检定结果才比较可靠。(3)反响程度随剂量的变化要有显著改变。(4)剂量与反响的关系可用适当的数学式表示。四、剂量和反响的关系生物测定是利用药物不同剂量引起生物体反响程度的变化以进行药物效价测定的，要计算效价，首先要研究剂量和反响之间的关系。许多药物在相当宽的剂量范围里，剂量和反响之间存在着一定的规律性，并可用一定的数学公式表示，研究剂量和反响关系，根本内容就是找出这个规律，并采用坐标转换的方法解决曲线转换为直线的问题，以便用最简单的方法进行统计处理。通常以剂量作横坐标，反响为纵坐标，在方格纸上划点连线，由所成的剂量－反响曲线形状推断剂量或反响应作何种函数转换,直至剂量－反响线在一定范围内成直线。剂量－反响线的斜率对检定结果有重要意义，斜率越大，说明反响对剂量变化越敏感，实验结果就越精密可靠。