口腔生物学课件

口腔微生物學第一節口腔生態系及其影響因素

生物之間，生物與其環境之間的相互關係稱生態系ecosystem一、生態系和生態學腸道菌數百種，數量達100兆，重量2千克顯微鏡下：花草叢生，丹藤翠蔓，生機盎然研究生物與其環境的相互依賴和相互制約的科學為生態學（ecology)1985ＶolkerRush提出細胞水準或分子水準的生態學為微生態學（microecology)

生態位，小生境 niche

生態點 biotopes

生境 habitat環境（environment）生物體周圍許多不同複雜程度的實體生態系建立的中心原則是生物體對其賴以生存環境的影響二次細菌定植（Secondarybacteriacolonization)先鋒菌pioneer定植colonize

環境改變(environmentchanges)生態連續ecologicalsuccession（生態演替）生物體棲息在一個變化環境中的過程個體(individual)生物體的社會群體(community)極期群落(climaxcommunity)互生mutualism

相互受益共棲commensahism一方受益，一方不受損寄生parasitism一方受益，一方受損無損共生amensalism雙方均不受益受損雙方受損共生symecrosis雙方受損生物間的共生關係symbiosis二、口腔生態系人類與正常菌群間的關係互生Normalflora正常菌叢(固有菌叢)口腔腸道(大腸桿菌)300餘種，人體細胞1014，僅10%為哺乳動物細胞，其他為微生物口腔生態系（oralecosystem)

口腔正常菌叢之間及其與宿主之間的相互作用S.mutans口腔微生物與宿主的相互作用

有益作用損害作用有益作用對外源性微生物的抑制

entagonism,microbialinterference

阻止和限制外源微生物的入侵通過競爭營養物質產生抑制性代謝產物佔據空間位置降低PH值降低氧化還原電勢導致機體產生天然抗體

對宿主免疫系統刺激唾液腺的神經支配有助於組織和器官正常發育定菌動物腸道發育不良營養功能

VitK,Biotin,B6,B2長期使用抗菌素：營養吸收，維生素代謝障礙，外源性感染內源性感染為外源性感染提供條件

pH，Eh值改變，酶的產生使宿主致敏損害作用三、口腔微生物的獲得與演替（一）獲得：胎兒無菌，產道獲得，雙親影響（二）演替(physiologicalsuccession)1.新生兒期

2.幼兒

3.青春期和成人期四、口腔生態系的影響因素軟硬組織屏障獲得性膜複雜的口腔環境舌、齦上皮、齦溝、頰、齶、釉質、牙本質、牙骨質（一）物理化學因素溫度一般細菌可在-5℃~55℃

環境中生存口腔食品溫度變化幅度±60º

嗜冷菌<25℃

嗜熱菌>45℃

嗜溫菌25~37℃氧張力絕對需氧菌Obligateaerobes絕對厭氧菌Obligateanaerobes兼性厭氧菌facultativeanaerobes耐氧厭氧菌aerotolerantanaerobes微嗜氧菌microaerophiles%表示舌前16.4

舌後12.4

頰褶0.3Eh(oxidation-reductionpotentials)指兩個電極之間的電位差

+75mV~-50mVpH氫離子濃度反映為pH值口腔pH以唾液為代表5.6~7.6影響因素外源性物質:糖類，酸性、鹼性物質細菌發酵唾液緩衝能力:流速唾液齦溝液血素(hemin)牙齦卟啉菌生長酶類透明質酸酶，蛋白酶等（二）營養物質的利用唾液抗體

唾液中主要為sIgA

齦溝液中主要為IgG2.蛋白質

糖蛋白粘蛋白富脯蛋白富酪蛋白過氧化物酶乳鐵蛋白溶菌酶（三）宿主因素糖蛋白粘蛋白(mutan)氨基己糖>4%MGI保護、潤滑、抗微生物參與獲得性膜形成

MGII凝固細菌

富脯蛋白(proline-richproteins,HRPS)

參與鈣離子濃度調節富酪蛋白(stathrine)

抑制羥磷灰石形成，使唾液中羥磷灰石達到飽和和促進再礦化。過氧化物酶——硫氫酸鹽抗菌系統(salivaryperoxidase)SCN-+H2O2OSCN-硫氫酸鹽 SCN氧化中間產物過氧化物酶乳鐵蛋白(lactoferrin)

能與鐵結合，使部分需鐵細菌受抑制溶菌酶(lysozyme)

能介導細菌聚集，破壞細胞膜，啟動細菌的自溶素唾液功能潤滑維持口腔粘膜完整性軟組織修復維持生態平衡凝集作用抗菌作用細菌附著1.粘附(attachment)2.細菌間作用聚集（aggregation）共聚集（co-aggregation）（四）細菌因素第二節牙菌斑與生物膜一、獲得性膜的形成細菌非直接附著至牙面清潔牙面後幾分鐘~數小時內形成

24小時後0.01~1

m成份

glycoproteinsphosphoproteinslipidGingivalcrevicularfluid獲得性膜成分對附著的影響氨基酸缺乏系統分析糖蛋白中的寡糖oligossacharides

介導初期附著二、微生物聚集

microbialcolonization（一）初期附著——非特異性附著鈣橋學說：脂磷壁酸——酸性唾液糖蛋白細菌表面疏水性(hydrophobicity)靜電學說Ca++（二）細菌附著——高度選擇性（selectivemanner)配位體理論(ligands)adhesin--receptors(oligossacharides)

早期附著細菌：

S.sanguis S.oralis占鏈球菌的95% S.mitisbioran占細菌總數的50%S.sanguis附著至人類唾液糖蛋白終末唾液酸殘基S.oralishasagalactose-bindingadhesinActinomycesviscosusproline-richprotein,statherin附著至S.sobrinusglucan附著至S.mutans與齲病關係密切，但數量<2%初期鏈球菌唾液中某種微生物濃度與附著量呈正相關第一個細胞附著至牙面所需細菌濃度

S.mutans104~105/mlsalivaS.sanguis103/ml三、微生物演替（Microbialsuccession)Strepococcus-dominatedplaquetoaplaquedominatedbyactinomyces.

原有微生物為繼發性微生物生長創造條件細菌創造一種環境逐漸被其他適應性細菌取代吸引繼發入侵者或不利其自身附著。成熟菌班中無S.orealis牙菌班變厚，O2缺乏有利於兼性厭氧菌生長，9天後牙菌班兼性厭氧及厭氧微生物為主幾周後達到平衡四、成熟牙菌斑

Maturedentalplaque早期生長：細胞分裂所致繼之：吸附玉米棒狀中心絲狀菌玉米棒狀中心絲狀老菌斑：內層稠密包繞G+菌pleomorphic菌其中放線菌為主，外層鬆散菌班附著圖菌斑附著過程第三節口腔正常菌群一、來源母體近親二、菌叢固有菌叢indigenousflora增補菌叢supplementalflora暫時菌叢transientflora口腔微生物細菌真菌支原體口腔原蟲病毒葡萄球菌屬(Staphylococcus)口腔球菌屬(Stomatococcus)鏈球菌屬(Streptococcus)消化球菌屬(Peptococcus)和消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)奈瑟球菌屬(Neisseria)韋榮球菌屬(Veillonella)放線菌屬(Actinomyces)優桿菌屬(Eubacterium)丙酸桿菌屬(Propionibacterium)口腔菌屬雙歧桿菌屬(Bifdobacterium)乳桿菌屬(Lactobacillas)羅氏菌屬(Rothia)諾卡菌屬(Nocardia)嗜血菌屬(Hemophilus)放線桿菌屬(Actinobacillus)艾肯菌屬(Eikenella)口腔金氏菌(K.orale)彎曲桿菌屬(Campylobacter)二氟化碳噬纖維菌屬(Capnocytophaga)擬桿菌屬(Bacteroides)普雷沃菌屬(Prevotella)卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)梭桿菌屬(Fusobacterium)纖毛菌屬(Leptothrix)沃林菌屬(Wolinella)月形單胞菌屬(Selenomonas)螺旋體(Spirochaeta)牙周骨組織生物學

牙周組織有再生的可能嗎？為什麼受壓側骨吸收，牽引側骨形成？骨整合形成的機理是什麼？牙周韌帶樣結構可行嗎？牙周組織(Periodontium)

牙周膜(Periodontalligament)

牙齦(Gingiva)

牙骨質(Cement)牙槽骨(Alveolarbone)

“做學問要於不疑處有疑，待人要於有疑處不疑。”

胡適牙槽骨組織的生物學特點

第一節一、牙槽骨的組織形態特點固有牙槽骨密質骨松質骨（alveolarboneproper）（corticalbone）（spongebone）固有牙槽骨(篩狀板、硬骨板）束狀骨（bundlebone）束狀骨（bundlebone）束狀骨（bundlebone）密質骨松質骨牙槽骨牙槽骨牙槽骨二、牙槽骨的生物特徵成分無機成分70%有機成分22%水8%羥基磷灰石I型膠原95％蛋白糖原非膠原蛋白形態密質骨松質骨胚胎發育：膜內成骨

牙槽骨是高度可塑性組織，也是人體骨骼最活躍的部分。三、牙周其他鈣化組織（牙骨質）牙骨質（按有無細胞）無細胞牙骨質有細胞牙骨質（原發性牙骨質）（繼發性牙骨質）牙骨質（按纖維來源以及有無細胞分類）無纖維無細胞牙骨質外源纖維無細胞牙骨質混合纖維細胞牙骨質內源纖維細胞牙骨質牙骨質的生物學特徵

在生理情況下，牙骨質不像骨組織可以不斷地改建和重塑，只有新生，不被吸收，只有在病理情況下才會發生吸收。四、牙周膜牙周膜的細胞成纖維細胞、巨噬細胞和未分化間充質細胞

成牙骨質細胞和破牙骨質細胞

成骨細胞和破骨細胞

上皮剩餘牙周膜的功能支持功能（supportivefunction）

改建功能（remodelingfunction）

感覺功能（sensoryfunction）營養功能（nutritivefunction）

四、研究骨組織代謝的意義牙周病

顏面骨組織缺損

牙列缺失和缺損

即刻及延期種植口腔正畸顳下頜關節以及根尖病變骨改建的細胞學基礎

第二節一、成骨細胞（osteoblast）骨祖細胞（osteoprogenitorcell）前成骨細胞（preosteoblst）成骨細胞（osteoblast）骨細胞(ostocyte)骨襯裏細胞(bone-liningcell)（不活躍的成骨細胞）

活動性成骨細胞的胞漿嗜鹼性，並具有蛋白合成的細胞結構，如大量的粗面內質網和發達的高爾基體。非活動性成骨細胞似成纖維細胞，扁平狀，類似於內皮細胞。

成骨細胞合成與分泌的蛋白主要是I型膠原，其他蛋白有：鹼性磷酸酶、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋蛋白、蛋白多糖、磷蛋白、激素和骨生長因數等。二、破骨細胞（osteoclast）破骨細胞的來源

破骨細胞來源於造血系統的單核細胞，與巨噬細胞有共同的前體，在特定條件下融合成多核細胞破骨細胞的功能吸收骨、牙本質和鈣化的軟骨破骨細胞吸收骨的過程骨表面附著細胞極性化形成封閉區形成骨吸收陷窩脫離骨面、轉移破骨細胞的鑒定標準三、骨細胞（osteocyte）三、成骨細胞與破骨細胞的關係

成骨細胞參與破骨細胞在骨表面附著的調節

成骨細胞合成破骨細胞骨吸收刺激因數

成骨細胞參與破骨細胞分化成熟的調節五、牙周韌帶細胞（periodontalligamentcell，PDLC）牙周韌帶細胞具有異質性(heterogeneous)。成骨細胞成牙骨細胞牙周韌帶細胞“大膽假設，小心求證。”

胡適牙周韌帶細胞具有異質性牙周韌帶細胞可能含有幹細胞Figure1:IsolationofadulthumanPDLSCsPDL：牙周韌帶；PDLSCs：牙周韌帶幹細胞；DPSCs：牙髓幹細胞；BMSSCs：骨髓基質幹細胞：STRO-1：幹細胞表面標誌；CD146/MUC18：幹細胞表面標誌；GAPDH：內標；Scleraxis：腱細胞的特徵轉錄子Figure2:Expressionofcementoblastic/osteoblasticphenotypebyPDLSCs

ALP：鹼性磷酸酶；MEPE：基質細胞外蛋白；BSP：骨涎蛋白；OSC：骨鈣素；TGFR1：TGF受體；HSP90：assesstheamountofproteinloadedpersampleFigure3:AdipogenicdifferentiationofPDLSCsOilredOpositivelipidclusters

：脂肪細胞的特徵標誌之一PPAR2：脂肪細胞的標誌lipoproteinlipase(LPL)：脂肪細胞的標誌Figure4:Generationofcementum-likeandPDL-likestructuresinvivobyPDLSCsFigure5:GenerationofcollagenfibresbyPDLSCsinvivoFigure6:PDLSCsinperiodontaltissuerepairinimmunocompromisedrats牙周韌帶細胞具有異質性具有纖維細胞表型牙周韌帶細胞OBPDLCBODBALP+++++++++ColI+++++++Periostin++++++_Cbfa1+++++++++OCN+++_++++++BSP++_++_PDL：牙周韌帶PDL-L2:成纖維表型的PDLCMC3T3-E1：成骨細胞系NIH3T3：成纖維細胞系C3H10T1/2：間充質細胞系影響骨改建的生物學因素

第三節一、骨改建影響因素概論全身因素（systemicfactors）局部因素（localfactors）其他因素全身因素鈣調節激素甲狀旁腺素(Parathormone，PTH)1，25-(OH)2維生素D3

(

activevitaminD3)降鈣素

(Calcitonin，CT)性激素雌激素（Estrogen）睾丸激素（Testosterone）其他生長激素（growthhormone）甲狀腺激素（Thyroidhormone）皮質醇激素（Cortisol）局部因素生長因數（Growthfactors）白細胞介素Interleukins(IL)腫瘤壞死因數（Tumournecrosisfactors）干擾素（Interferons）集落刺激因數（Colonystimulatingfactors）其他生長因數胰島素樣生長因數

Insulin-likegrowthfactors(IGF-I&II)轉化生長因數-β家族

Transforminggrowthfactors(TGFβs1-3) 成纖維細胞生長因數

Fibroblastgrowthfactorsacidicandbasic(aFGF&bFGF)血小板衍生的生長因數

Plateletderivedgrowthfactor(PDGF)骨形成蛋白

BonemorphogeneticproteinsBMPs1-7白細胞介素IL-1β

IL-3(MultiCSF)IL-4IL-6IL-8腫瘤壞死因數TNFαTNFβIFNγ

干擾素集落刺激因數GM（粒細胞、巨噬細胞）-CSFM（巨噬細胞）-CSF前列腺素Prostaglandins甲狀旁腺激素相關肽

Parathyroidhormonerelatedpeptide

（PTH-RP）降鈣素相關肽

Calcitoningenerelatedpeptide(CGRP)其他（局部）其他電刺激

Electricalstimulus環境因素Environmental溫度氧水準酸堿平衡局部應力Localstresses二、第二信使

細胞信號分子包括：短肽、蛋白質、氣體分子（NO、CO）以及氨基酸、核苷酸、脂類和膽固醇衍生物等等。

其共同特點是：①特異性，只能與特定的受體結合；②高效性，幾個分子即可發生明顯的生物學效應，這一特性有賴於細胞的信號逐級放大系統；③可被滅活，完成資訊傳遞後可被降解或修飾而失去活性，保證資訊傳遞的完整性和細胞免於疲勞。

脂溶性信號分子，如甾類激素和甲狀腺素，可直接穿膜進入靶細胞，與胞內受體結合形成激素-受體複合物，調節基因表達。

水溶性信號分子，如神經遞質、細胞因數和水溶性激素，不能穿過靶細胞膜，只能與膜受體結合，經信號轉換機制，通過胞內信使（如cAMP）或啟動膜受體的激酶活性（如受體酪氨酸激酶），引起細胞的應答反應。所以這類信號分子又稱為第一信使（primarymessenger），而cAMP這樣的胞內信號分子被稱為第二信使（secondarymessenger）。

目前公認的第二信使有cAMP、cGMP、三磷酸肌醇（IP3）和二醯基甘油（DG），Ca2+

第二信使的作用：轉換和放大的作用。cAMP和

IP3

均屬於G蛋白耦聯受體所介導的細胞信號通路激素→G蛋白耦聯受體→G蛋白→腺苷酸環化酶→cAMP→依賴cAMP的蛋白激酶A→基因調控蛋白→基因轉錄cAMP傳導途徑IP3傳導途徑胞外信號分子與細胞表面G蛋白耦聯型受體結合，啟動質膜上的磷脂酶C（PLC-β），使質膜上4，5-二磷酸磷脂醯肌醇（PIP2）水解成1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和二醯基甘油（DG）兩個第二信使，胞外信號轉換為胞內信號（圖8-21）三、骨改建的調節因數骨塑形（bonemodeling）和骨改建（boneremodeling）成骨細胞系和破骨細胞系間的交互作用間充質幹細胞前成骨細胞前破骨細胞成骨細胞破骨細胞PTHPTH-RPPGCytokineVitaminD3骨基質溶解BMP-2FGFIGF-1IGF-2TGF-β1TGF-β2M－CSFRANKLRANKc－fmsPTH作用的總效應是升高血鈣。PTH具有促進成骨和溶骨的雙重作用。實驗研究表明小劑量PTH可促進成骨作用，而大劑量則可促進溶骨作用。甲狀旁腺素PTH成骨細胞IGF-1FGF-2間充質幹細胞前成骨細胞成骨細胞骨襯裏細胞PTH-RP刺激成骨細胞功能阻止成骨細胞凋亡Bcl-2Bcl-XLPTHPTHRI1，25-(OH)2維生素D3

1，25-(OH)2維生素D3總的調節效果是使血鈣、血磷增高。對骨亦有溶骨和成骨的雙重作用。

作用與PTH相反，其作用是抑制破骨作用，抑制鈣、磷的重吸收，降低血鈣和血磷。降鈣素CT

直接抑制破骨細胞的生成，抑制骨鹽溶解、降低血鈣、血磷濃度。雌激素

對成骨細胞和破骨細胞均有作用，抑制骨鹽溶解，促進成骨。睾丸激素

對骨形成直接的促進作用，並且通過促進肌肉生長間接促見骨形成

可在脂肪細胞裏轉化為雌激素雌激素破骨細胞雌激素受體TGF-β促使細胞凋亡單核細胞前破骨細胞前破骨細胞雌激素衰竭的骨雌激素富集的骨IL-1βIL-1βIL-1β受體IL-1β受體IL-1β偽受體IL-1β和受體結合促進破骨細胞形成破骨細胞形成雌激素成骨系細胞TGF-β破骨系細胞破骨細胞分化繼續阻止破骨細胞分化RANKLOPGRANKL+RANKRANKL+OPG胰島素樣生長因數

促進成骨細胞增值，誘導成骨細胞分化。轉化生長因數-β家族

作用比較複雜、多變

促進成骨細胞增值、分化。

抑制IL-1和維生素D3

誘導的骨吸收和破骨細胞的成熟分化成纖維細胞生長因數

促進間充質細胞、前成骨細胞增值，不誘導成骨細胞分化。血小板衍生的生長因數

可以增加間充質細胞IGF的合成，對骨作用機理不清骨形成蛋白

目前已知的唯一可以獨立在體內異位成骨的生長因數腫瘤壞死因數

通過成骨細胞的介導，具有明顯的促進骨吸收的作用。

干擾素

可抑制前破骨細胞的增生、分化，從而抑制破骨細胞性骨吸收，是一種多功能的細胞因數，又是骨吸收抑制因數。ILIL-1α，β是骨吸收的有效的強力刺激因數，它可以刺激成骨細胞產生PGE2，介導骨吸收，還可刺激成纖維細胞與吞噬細胞產生膠原酶，活化破骨細胞而促進骨吸收IL-2可以通過刺激破骨細胞分泌促進骨吸收

IL-6為多功能的細胞因數，是介導破骨細胞性骨吸收的中心因數，具有顯著促進骨吸收的作用。

集落刺激因數M-CSF是破骨細胞分化過程中不可缺少的因數前列腺素

通過增加cAMP含量促骨吸收

幾乎所有促進或抑制骨吸收的細胞因數均影響PG的合成。

對成骨細胞的作用具有雙向性。

四、牙周韌帶細胞的調節因數

刺激增殖

誘導分化

刺激蛋白質的合成和分泌

促進附著

改變細胞形狀

刺激細胞移動血小板衍生的生長因數

調控細胞增殖，但對細胞外基質的合成和間充質細胞的分化沒有作用。胰島素樣生長因數

促進前成骨細胞增值，誘導成骨細胞分化。但對間充質細胞的分化和組織的血管化沒有作用。轉化生長因數-β

作用比較複雜、多變；

促進/抑制成骨細胞增值、分化。鹼性成纖維細胞生長因數

抑制牙周韌帶細胞形成礦化結節。骨形成蛋白

可以促進牙槽骨、牙骨質以及牙周韌帶樣結構的形成。力在骨改建中的作用第四節顱面骨組織變化研究的主要方法第五節口腔微生物分子生物學

什麼是遺傳物質？蛋白質20種氨基酸DNA四種堿基轉化實驗的結果說明……生命的主要遺傳物質去氧核糖核酸（DNA）DNA結構的推衍Chargaff:T+C=A+G A=T G=CX線衍射：

DNA在兩條鏈組成，相互平行核酸的組成DNA RNA去氧核糖 核糖腺嘌吟胞嘧啶 腺嘌呤胞嘧啶鳥嘌呤胸腺嘧啶 鳥嘌呤尿嘧啶雙鏈 單鏈DNA複製半保留複製DNA複製半不連接複製由於DNA多聚酶只能從5’→

3’方向合成DNA，因而半保留複製不能完全解釋。DNA複製的特點新合成的子代DNA與親代DNA完全一樣，保證了遺傳的穩定性。RNA信使RNA（mRNA)核蛋白體RNA（rRNA)轉運RNA（tRNA)RNA的生物合成——轉錄以DNA為範本合與RNA由RNA多聚酶合成從DNA上特定起始序列（啟動子）開始，至終止信號結束蛋白質的生物合成——翻譯遺傳密碼

由3個連續的核苷酸組成蛋白質的生物合成——翻譯蛋白質合成過程Ⅰ.氨基酸活化Ⅱ.蛋白質合成的起始AUG→甲醯化甲硫氨酸（fMet)Ⅲ.蛋白質合成的終止終止碼UAA、UGA、UAG蛋白質的生物合成——翻譯新生多肽的加工Ⅰ.fMet水解Ⅱ.磷酸化、糖基化、甲基化修飾Ⅲ.信號肽蛋白質向細胞外分泌基因表達DNA→RNA→蛋白質豐富的生命現象基因表達的調節機體的每一個細胞都有一套完全相同的基因共同表達的基因特異性表達的基因基因表達的調節共同表達的基因維持細胞基本結構、功能基因表達的調節特異性表達的基因紅細胞產生血紅蛋白B淋巴細胞產生抗體成牙本質細胞分泌牙本質蛋白基因表達調控的原因動力細胞內、細胞間，或細胞與外界環境間關係的變化。基因表達調節的方式啟動子強啟動子與RNA多聚酶有較強的結合能力，轉錄水準較高；弱啟動子則反之。基因表達調節的方式調節蛋白的作用—負向調節—正向調節負向調節乳糖操縱子學說正向調節原核生物基因表達的調節主要在轉錄水準真核基因生物調節多層次複雜性分子克隆技術限制性內切酶特定的識別序列，4~6個堿基對在識別序列內固定位置切割，5’–端磷酸基因，

3’-端羥基基團切割後形成粘性或平滑末端DNA連接酶催化DNA中相鄰3’羥基和5’磷酸基團之間形成3’，5’–磷酸二酯鍵。質粒細胞內獨立於染色體外的環狀DNA，能自我複製其上基因可借助宿主細胞的轉錄、翻譯系統得以表達分子2000~50000bpTpGEM

-TVector(3003bp)AmprlacZoriXmnI1994ScaI1875NaeI2695ApaIAatIISphIBstZINcoISacIIT7SpeINotIBstZIPstISaLINdeISacIBstXINsiISP6T1start14202631374655626273758294103112126

pGEM-TvectormapXhoISmaIXhoISmaIXhoISmaIpCIpCIA-PpGEM-T/A-P

A-PfragmentSub-cloningconstructionofrecombinantpCIA-PinsertionofA-PDNAfragmentintoplasmidpCIXhoISmaIT4LigaseA-Pfragment構建質粒的特點Ori區：複製起點Par區：保證質粒均勻分佈於子細胞多克隆區：人為構建，便於克隆操作選擇因數：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆後便於挑選接合在適當的條件下，雄性菌和雌性菌混合時形成配對的雄性-雌性菌，並有遺傳物質的單向轉移。雄性菌：含F性因數，染色體外環狀DNA轉化外源DNA能進入細胞內並通過整合至宿主DNA中或獨立複製保存於宿主細胞內。轉錄利用噬菌體為媒介，將供體DNA轉移到受體菌內的現象，能在自然狀態下發生。分子克隆常用技術DNA電泳基因轉移核酸雜交聚合酶鏈反應PCRDNA電泳可分離不同分子量的DNA

Ladder1234567891011121314Ladder對臨床菌株的第二次PCR擴增產物電泳圖譜分析

Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW核酸雜交原理：在一定條件下（溫度、pH值等）DNA雙股螺旋可解開並分離在一定條件下，兩股游離的互補的核苷酸可自行配對形成雙股SouthernBlot電泳、轉移、雜交確定分子量斑點雜交目標序列的存在目標序列的量聚合酶鏈反應PCR與齲病相關微生物的定量檢測方法細菌形態生化反應免疫反應分子生物學方法----分子探針雜交----RFLP----PCR唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用在人類口腔中檢出率很高茸毛鏈球菌可能比變形鏈球菌與齲損活躍性之間的關係更密切變形鏈球菌和茸毛鏈球菌唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用套式PCR快速檢測人類唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌.譚海平，邊專，樊明文，陳智，範兵.中華口腔醫學雜誌，2003，38：223-226唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用套式PCR(NestedPCR)5′

3′

TemplateOuterprimer2Outerprimer1ThefirstPCR5′

3′

Interprimer2Interprimer1NexttemplateThesecondPCR5′

3′

ThesecondPCRproduct本套式PCR的引物是分別根據變形鏈球菌gtfB基因和茸毛鏈球菌gtfI基因設計的內、外兩套引物（outerprimer,interprimer）gtfBgeneofS.mutansOuterprimerthp4Outerprimerthp3ThefirstPCRInterprimerthp8Interprimerthp7Outerprimerthp6gtfIgeneofS.sobrinusOuterprimerthp5ThefirstPCRInterprimerthp10Interprimerthp9ThesecondPCRThesecondPCR

抽提細菌染色體DNA(Igarashietal.1996)----細菌----唾液PCR反應過程第一次PCR反應

預變性:94℃4min

變性:94℃1min

退火:51℃1min30cycles

延伸:72℃2min

最後延伸:72℃5min

第二次PCR反應

abcdefghLadder12345678選擇外引物行第一次PCR後擴增產物電泳圖譜分析以變鏈菌組(MutansStreptococci)染色體DNA為範本

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7;6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.

MW(Kb)2.01.00.250.10.750.5

abcdefghLadder12345678選擇內引物行第二次PCR後擴增產物電泳圖譜分析

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7:6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.Marker:DL2,000Ladder

MW(Kb)2.00.750.51.00.250.1

Ladder123456第一次PCR的靈敏度

變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數量

Lane1:108CFU;Lane2:107CFU;Lane3:106CFU;Lane4:105CFUMW(Kb)2.00.750.51.00.25

2.0

0.5

Ladder1234561.00.750.25MW(Kb)第二次PCR的靈敏度

變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數量

Lane1:104CFU,Lane2:103CFU

Ladder1234567891011121314Ladder對臨床菌株的第二次PCR擴增產物電泳圖譜分析

Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW

Ladder12345LadderMW1.0(Kb)0.750.50.250.1

Ladder12345LadderMW2.0(Kb)1.00.250.10.750.5ABLane1.chromosomalDNAfromS.mutansIngbritt;2.chromosomalDNAfromS.sobrinus6715;3.salivasamplefromsubjectA;4.salivasamplefromsubjectB;5.salivasamplefromsubjectC.利用PCR直接從唾液樣本中檢測變形鏈球菌S.mutans和茸毛鏈球菌S.sobrinus(圖A)利用外引物(圖B)利用內引物分子克隆的主要步驟基因文庫的建立目的基因的篩選目的基因的分析原核生物基因文庫的建立提取細胞DNA限制性內切酶酶切DNA片段連接至質粒或噬菌體轉化宿主細胞（大腸桿菌）目的基因的篩選核酸雜交免疫學檢測目的基因的分析DNA序列啟動子分析推測蛋白質一級結構推測蛋白質二級結構口腔免疫學

OralImmunology非特異性免疫

生來具有，作用無針對性生物性屏障結構*

吞噬細胞*抗微生物物質*

天然免疫系統中存在著獨特的特異性口腔免疫體系特異性免疫

後天獲得，作用具有抗原針對性體液免疫----B細胞介導細胞免疫----T細胞介導

口腔免疫體系人體粘膜免疫系統

★器官性粘膜相關淋巴組織（Organizedmucosa-associatedlymphoidtissueO-MALT）★彌散性粘膜相關淋巴組織（Diffusemucosa-associatedlymphoidtissueD-MALT）口腔免疫學口腔免疫學

口腔免疫體系菌斑免疫口腔常見病免疫口腔生物學口腔免疫體系

(免疫角度)

非特異性免疫特異性免疫口腔免疫體系

(組織學角度)

﹡口外淋巴結

﹡口咽淋巴組織環

﹡固有口腔屏障口外淋巴結耳後淋巴結枕淋巴結頸前淋巴結鎖骨上淋巴結腮腺淋巴結頰淋巴結下頜下淋巴結骸下淋巴結口腔免疫體系

TB定居增殖場所產生Ab致敏LC部位免疫應答場所外周免疫器官*口咽淋巴組織環

齶扁桃體palatinetonsils舌扁桃體

lingualtonsils咽扁桃體pharyngealtonsils黏膜下淋巴樣組織scatteredsubmucosallymphoidcell唾液腺淋巴樣組織salivarygland

lymphoidtissue牙齦淋巴樣組織gingivallymphoidtissue口腔免疫體系

口咽淋巴組織環口腔免疫體系

扁桃體tonsils

複層鱗狀上皮

隱窩淋巴小結粘液腺口咽淋巴組織環固有口腔屏障唾液屏障粘膜物理屏障免疫球蛋白屏障免疫細胞屏障口腔免疫體系

固有口腔屏障口腔免疫體系

唾液腺唾液

1000-1500ml/dpH6-7.9大唾液腺小唾液腺唾液屏障齦溝液

非特異性免疫成分粘蛋白乳鐵蛋白過氧化物酶溶菌酶細胞因數

特異性免疫成分SIgAIgGIgMIgD固有口腔屏障唾液屏障齦溝液

gingivalcrevicularfluidGCF

唾液結合上皮上皮組織毛細血管

齦溝液細胞成分中性粒細胞單核吞噬細胞淋巴細胞可溶性成分

IgGIgAIgM補體細胞因數白蛋白溶菌酶前列腺素纖維蛋白原轉鐵蛋白唾液非特異性免疫成分

粘蛋白（mucin）產生：頜下腺小唾液腺舌下腺粘液細胞作用：抗乾燥防損傷抵禦微生物唾液屏障導管分泌部唾液屏障乳鐵蛋白(Lactoferrin)

產生：漿液細胞中性粒細胞作用：抗菌

coccuslactoferrinFeFe羧基陰離子唾液屏障溶菌酶

(Lysozyme)溶菌酶IgAH2O2過氧化物促溶離子補體抗菌乙醯氨基葡萄糖乙醯胞壁酸溶菌唾液屏障

富組蛋白富脯蛋白

Histidim-richproteinsHRPSProline-richproteinsPRPS

抑制鈣磷在過飽和下形成晶體抑制變形鏈球菌、白色念珠菌改變微生物粘附性

唾液屏障

＊健康牙周C3C4

＊炎症牙周C3aC3bC5a

＊炎症控制C3aC3bC5a補體

Complement

唾液屏障補體啟動與活性免疫複合物C142C3C3a、C5aC3bC3bIgG附著吞噬殺傷菌斑抗原+抗體經典途徑C3bB細菌脂多糖、凝聚的IgG、IgA旁路途徑組胺SRS-A血管滲透性增加C5b6789細胞膜溶解細胞因數（cytokine）：

是指由活化的免疫細胞和某些基質細胞分泌的、介導和調節免疫、炎症反應的小分子多肽，是除Ig和補體外的另一類非特異性免疫效應物質。唾液特異性免疫成分

免疫球蛋白大唾液腺齦溝液小唾液腺粘膜下淋巴細胞粘膜物理屏障

機械阻擋屏障膜被顆粒通透屏障基底膜濾過屏障正常菌群拮抗作用

淋巴細胞多形核白細胞漿細胞（和淋巴細胞）早期病損

病損確立期初期病損

免疫細胞屏障不成熟的樹突狀細胞位於上皮，成熟的樹突狀細胞位於結締組織不成熟的樹突狀細胞可因暴露於牙齦卟啉菌而導致其活化/成熟並進入結締組織中，啟動的樹突狀細胞能刺激T細胞以劑量依賴式的方式增殖。

TLRs新發現的受體TLRs（toll-likereceptors,TLRs）根據果蠅基因組中已知的Toll基因命名TLR4是TLRs家族中的脂多糖感測器TLR2識別脂磷壁酸、脂蛋白、纖毛和肽聚糖TLR3識別雙鏈RNATLR9識別DNA牙齦組織細胞可表達TLRs，而且在某些情況下，其表達受到細菌因數的調節天然免疫系統中細胞內信號脂多糖結合到血清蛋白－脂多糖結合蛋白上，然後被傳遞給可溶性CD14(sCD14)或膜結合CD14(mCD14)與CD14結合的脂多糖和包括TLR4和輔助蛋白MD-2的細胞表面受體複合體相互作用，並始動了一條或多條導致炎症介質表達的細胞內通路

MØ中性粒膠原酶溶酶體酶天然免疫系統中存在著獨特的特異性不同Toll樣受體識別不同分子成分，從而啟動不同天然免疫途徑受體結構差別是脂肪酸醯化和磷酸化，這些結構特異性是決定宿主細胞對細菌反應的關鍵成分

趨化因數細胞因數樹突狀唾液屏障細胞因數（cytokine）免疫球蛋白屏障sIgA的合成、組裝、分泌4231567漿細胞1IgA的合成和J鏈2形成二聚體3分泌分泌性上皮細胞4合成分泌片段5穿膜分泌成分6轉運唾液導管7分泌到唾液導管免疫球蛋白屏障

阻抑粘附控制菌斑溶解細菌中和病毒中和毒素免疫排除SIgA功能免疫球蛋白屏障

IgM

含量1/50

代償作用溶菌作用調理作用IgG

含量1/20

齦溝液中多炎症時可高於血清細胞因數（cytokine）

是指由活化的免疫細胞和某些基質細胞分泌的、介導和調節免疫、炎症反應的小分子多肽，是除Ig和補體外的另一類非特異性免疫效應物質。一、CK命名1968年Dumonde首次提出LF概念1979年第2屆LF國際會議命名IL-1,2…淋巴細胞產生的－－淋巴因數單核巨噬細胞產生的－－單核因數目前，上述所有因數，統稱細胞因數。二、CK來源三類：活化的免疫細胞基質細胞類某些腫瘤細胞三、細胞因數分類1、傳統分類法（按作用靶C分類）

Mφ:MIFMCMAFPMN:LIFLCF組胺釋放因數

LC:TFILMF

其他：TLCSF2.按在免疫應用的主要作用分類：

非特異性效應作用：

MIFMAFLIFLT

非特異性調節作用：

刺激作用IL-1~6IFN-γ

抑制作用免疫應答抑制物等

抗原特異性細胞因數：

T輔助因數T抑制因數3.按主要功能分類

介導天然免疫IL-1.6.8IFN-α.βTNF-α

激發抗感染的炎性反應調節LC反應IL-2.4TGF-β

啟動炎CIL-5IFN-γLT

啟動NK等非特異效應細胞刺激生血IL-3.7CSFEPO

刺激血細胞成熟，形成集落四、細胞因數的共同特點1、理化特性：低分子量（﹤80KD）的分泌型糖蛋白多數以單體形式存在少數為雙體形式：

IL-5、12M-CSFTGF-β4、細胞因數受體（CKR）造血生成素受體超家族Ig超家族成員干擾素受體超家族5、CK生物學作用特點作用：促靶C增殖分化增強對感染抵抗力調節免疫應答、炎症反應影響反應強度、持續時間細胞代謝作用強弱取決於：

CK局部濃度

靶C敏感性

其他CK的影響作用的雙向性：

適量－－增強免疫過度－－抑制作用6、CK網路性：形成：一種細胞因數可由多種細胞產生一種細胞可產生多種CK單核－巨噬BNK內皮成纖維表皮

IL-1活化TIL-1.6.9.10.13IFN-γTGF-βGM-CSFIL-1誘生

IL-1.2.4.5.6.8IFN-α.βIL-2IFN-γTNFLTIL-2IL-1.5.6.7TNF促進

IL-2R表達IL-1降低TNFR密度

TNF細胞毒作用細胞因數間可相互誘生

細胞因數調節其受體表達

CK生物活性間相互影響IL-1

曾用名來源分子生物學淋巴細胞啟動因數(LAF)活化的單核/巨噬細胞15-17KDB細胞活化因數(BAF)樹突狀朗罕上皮IL-αPI:5.0IL-βPI:7.0胸腺細胞增生因數(TPF)內皮結織成纖維IL-1R80KIg超家族成員神經膠質B分佈T.成纖維.成骨

CD4＞CD8IL-2

曾用名來源分子生物學

T細胞生長因數活化

CD4+T14~17KD(TCGF)CD8+TIL-R由α.β二鏈組成

分泌峰見活化後4h半衰期6.9分鐘G1SIL-2IL-3

曾用名來源分子生物學多集落刺激因數主活化CD4+26KD(multi-CSF)

IL-3R140KD屬促紅細胞生成系家族生物學活性

淋巴C

單核/巨噬造血幹細胞粒C分化成熟紅細胞並形成集落巨核CIL-3IL-4

曾用名來源分子生物學B細胞刺激因數1活化CD4+T30KD(BSF-1)IL-4R60~75KDB細胞生長因數1CD8+T肥大C屬ERS成員，可表達

(BCGF-1)於T.B.胸腺.骨髓T細胞生長因數2Mφ.肥大

(TCGF-2)許多細胞可編碼可溶性IL-4R的mRNAIL-5曾用名來源分子生物學T細胞替代因數活化的CD4+T18KD,以45～60KD(TRF)形式存在B細胞生長因數2(BCGF-2)IgA增強因數活化的肥大C(IgAEF)嗜酸粒C分化因數(EDF)生物學活性誘導IL-2R表達協同刺激B增殖分化誘導嗜酸粒活化誘導IgA合成及IgM增強分化IgE(協同IL-4)誘導造血細胞分化誘導Tc分化IL-5IL-6曾用名來源分子生物學B細胞刺激因數T.B.單核-巨噬2~26KD(BSF-2)IL-6R屬促紅B細胞分化因數成纖維.內皮.角質細胞生產素(BCDF)超家族雜交瘤漿細胞瘤小膠質表達於活化B.生長因數(HPGF)靜止T.NKIFN-β2.26KD蛋白肝C等肝細胞刺激因數(HSF)生物學活性增強造血祖C分化B增殖分化,誘生IgM.G.A集落形成誘導肝C急性期反應EB病毒轉化的B生長Pr合成增強NK.Tc殺瘤活性促CD4+CD8+T增殖生長參與炎症引起發熱IL-6IL-7曾用名淋巴細胞生成素1產生細胞骨髓及胸腺基質細胞分子量17.4KDIL-7生物學活性促進前T、前B細胞增殖促進成熟T細胞生長促進血小板生成CD(clusterofdifferentiation)分化抗原是LC在分化過程中產生的抗原。細胞發育不同階段，表達不同。幹細胞CD2+7+IL-7…CD2+7+3+CD4823+CD4823+CD423+CD823+Ⅱ限制Ⅰ限制IL-7……胸腺皮質髓質IL-8曾用名來源分子生物學中性粒C趨化Tc8-10KD因數(NCF)PI8~8.5粒C活化因數單核-巨噬.內皮依結構分兩個亞(NAF)家族中粒.T.單核TC趨化因數血小板.中粒.瘤C株堿粒有受體IL-8活性IL-1IL-8趨化…………中粒酸粒堿粒T細胞炎症反應IL-9

曾用名來源受體分佈

P40活化CD4+TTH2Mφ促TH在無抗原條件下長期存活與IL-2協同促進胚胎胸腺C的增殖促進肥大生長，增強肥大對IL-3的反應性促進IL-6產生對體液免疫正調節IL-10

曾用名来源

细胞因子结合抑制TH218.7KDPI8.9

因數(CBIF)與IL-1~7.9生物學效應相應抑TH1產生CK如IFN-γIL-2.3IFN-βGM-CSF促TH2增殖促肥大，胸腺細胞增殖抑制LPS誘導的Bcell增殖.IL-10多克隆Bcell活性IL-11(新的造血細胞因數）來源：骨髓基質細胞活性：介導多系祖細胞擴增分化單獨或與IL-3協同，提高巨核細胞，血小板數是一種有效的紅細胞生成刺激因數體外與IL-6有類似作用多能定向幹C單能定向幹C成熟子代細胞多能幹C髓系幹C淋巴系幹C粒/單核系幹C巨核幹C紅系幹C前驅BC前驅TC粒C/單核C血小板紅細胞BCTCIL-11IL-12曾用名來源分子生物學自然殺傷細胞BC70KD刺激因數(NKSF)EBV轉化BC受體分佈於細胞毒淋巴C成熟Mφ啟動的T、NK因數(CLMF)LPS