平面色谱法课件

平面色谱法27一月202450-2一、平面色谱法的分类：薄层色谱法（TLC）：将固定相于惰性硬质板上涂成一薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法。其原理同柱层析。纸色谱法：属分配色谱法，固定相为吸附于滤纸上的水分，流动相一般为不与水混溶的有机溶剂。薄层电泳法：带电荷的被分离物质（如蛋白、核苷酸、多肽、糖类等）在惰性的支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶等）上，以不同泳动速度向相反电极方向移动而分离。19.1平面色谱法的分类和原理27一月202450-3二、平面色谱法参数1、定性参数比移值（retardationfoctor）

Rf=L/L0可用范围：0.2～0.8最佳范围：0.3～0.527一月202450-4相对比移值(relativeRf)：Rr＝Rf（i）/Rf（s）＝Li

/Ls

重现性和可比性较Rf好27一月202450-52、相平衡参数—K

和k

与Rf

的关系

Rf＝1/(1+k)＝1/(1+KVs/Vm)k,K＝0，Rf

＝1k,K＝∞，Rf

＝03、面效参数—n和H理论塔板数n：n

＝16(L/W)2塔板高度H：H

＝L0/nRf与R’类似27一月202450-64、分离参数分离度(resolution，R):

两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度的比值。

R=2(L2－L1)/(W1+W2)=2d/(W1+W2)在平面色谱中，R应大于127一月202450-7分离数（seperationnumber，SN）：

定义：在相邻斑点分离度为1.177时，在Rf为0和1.0之间能完全分离的组分斑点数。SN越大，平面的容量越大，一般薄层板的SN

在10左右，高效薄层板可达20。计算SN:

(W1/2)0、(W1/2)1分别为由薄层色谱扫描所得的Rf＝0和Rf＝1的组分的半峰宽27一月202450-827一月202450-9薄层色谱法的主要类型吸附薄层色谱法：s－固体吸附剂分配薄层色谱法：s－吸留在载体表面的固定液和吸水达17%以上的硅胶。经典薄层色谱法现代薄层色谱法19.2薄层色谱法27一月202450-10modernTLC

27一月202450-11薄层色谱法的一般流程27一月202450-12分离能力强，斑点集中；灵敏度高，几十ng～几μg即可检出；速度快，几至几十min，一次可展开多个试样；试样处理简单，对被分离物质性质没有限制；上样量比较大，可以点状或条状点样；仪器简单，操作方便，可保留彩色图谱。应用广泛，尤其对药物的鉴别，《中华人民共和国药典》2010版中许多药物采用此法。薄层色谱法的特点27一月202450-13

吸附剂，adsorbent1.硅胶

2.氧化铝

3.聚酰胺一、薄层色谱的固定相27一月202450-141.硅胶（SiO2·H2O，silicagel）结构：内部—硅氧交联结构→多孔结构

表面—硅醇基→氢键作用→吸附活性中心适用范围：硅胶具有微酸性，适于分析酸性或中性物质27一月202450-15基本特性：易形成氢键：与极性物质或不饱和化合物。物质极性↑，吸附能力↑，不易洗脱。吸附活性次序：活泼型>束缚型>游离型吸附活性等级：与含水量有关，含水高，活性级数高，吸附能力弱。活化与失活：吸水→失活→105～110OC烘干30-60min(可逆失水)→吸附力最大→500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力。27一月202450-1627一月202450-172.氧化铝由氢氧化铝在400～500℃灼烧而成种类特性使用范围碱性氧化铝混有碳酸钠等成分而具碱性，pH约为9~10适合中性或碱性化合物的分离。尤其适合分离生物碱等碱性成分中性氧化铝除去碱性成分水洗至中性而得，pH约为7~7.5适合于对酸碱性不稳定的化合物酸性氧化铝用稀硝酸或稀盐酸处理而成，pH约为4~5中和了碱性杂质，并带有NO3—或Cl—，具一定的离子交换剂的性质，适于酸性成分的柱色谱。27一月202450-18氧化铝吸附活性：与含水量有关，水分增加，等级增大，活性降低。硅胶含水量%活性等级氧化铝含水量%活化温度05ⅠⅡ03300－400℃15Ⅲ6150－300℃2538ⅣⅤ1015100－150℃27一月202450-193.聚酰胺（polyamide）

聚酰胺（polyamide）为高分子聚合物。属氢键吸附作用原理27一月202450-20聚酰胺的性质：聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿和丙酮等常用溶剂，对碱比较稳定。但对酸，尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰乙酸和甲酸中。水溶液装柱上样：水使组分与聚酰胺之间形成氢键的缔合能力增强，有利于聚酰胺对组分的充分吸附。常见溶剂对聚酰胺柱色谱的洗脱能力的顺序：水＜甲醇＜丙酮＜氢氧化钠水溶液＜甲酰胺＜二甲基甲酰胺＜尿素水溶液。27一月202450-211、选择原则：三角律*二、展开剂(developer)27一月202450-222、常用溶剂极性强弱顺序：水>酸>吡啶>乙腈>甲醇>乙醇>正丙醇>正丁醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷>甲苯>苯>三氯乙烷>四氯化碳>环己烷>石油醚3、展开剂选择：单一溶剂和多元溶剂系统，根据分离情况通过多次实验去选择。理想展开剂要求达到：

Rf=0.3～0.8,ΔRf≥0.0527一月202450-23制板→点样→展开→显色→分析1、薄层板的制备：软板、硬板，自制或购买商品板板材：玻璃、锡箔纸、塑料规格：涂铺：无气泡、匀浆、均匀、厚250μm活化：三、薄层色谱操作方法27一月202450-24制板设备和仪器27一月202450-25（1）点样要求：合适的溶剂样品浓度点样量点样位置样点大小样点间隔2、点样27一月202450-26不同溶剂对斑点展开前后的影响27一月202450-27（2）点样方式点状点样：方法一，借助毛细管进行点样方法二，借助注射器式点样器进行点样方法三，借助于点样仪器进行点样带状点样：斑点分辨率高、精密准确，适合定量。自动点样：自动点样仪可由电脑和相应的软件控制吸样、点样、清洗等全过程，可点状、带状及方形点样。点状为接触式点样，带状和方形为喷雾式点样。27一月202450-28

点样器与点样效果27一月202450-29点样前需注意：确认板的清洁27一月202450-303、展开（1）展开方式：一维单向展开：二维双向展开：强迫流动展开27一月202450-31一维单向展开方式27一月202450-3227一月202450-33

27一月202450-34（2）影响展开的因素和注意事项①环境的相对湿度27一月202450-35（2）影响展开的因素和注意事项②溶剂蒸气的影响：薄层色谱是固定相、液态展开剂相及展开室内的蒸气相共同构成的一个复杂的色谱分离过程。展开室内三相之间达到平衡的程度即饱和27一月202450-36饱和操作的必要性：重现性与克服边缘现象27一月202450-37温度：展开方式：展距：展开室的放置：

27一月202450-38结束展开：展距合适、标前沿、除溶剂斑点定位方法：可见光下观察紫外灯下观察显色剂显色：通用：10%硫酸乙醇溶液；碘蒸气；专用：碘化铋钾—生物碱；

三氯化铁—黄酮；

茚三酮—氨基酸4、展开结束与斑点定位27一月202450-39

生物自显影检测系统生物自显影检测系统浸渍槽浸渍槽生物自显影检测系统27一月202450-40

光学检测定位仪器27一月202450-41斑点比移值对照法：在多种展开系统中，与标准物质进行Rf

值比较。四、薄层色谱的定性分析

27一月202450-42斑点显色特征法：保存彩色图谱四、薄层色谱的定性分析27一月202450-43薄层扫描法鉴别：四、薄层色谱的定性分析（1）斑点的原位光谱扫描定性

27一月202450-44（2）薄层色谱的全程扫描定性

27一月202450-45（3）薄层的三维扫描光谱图定性

27一月202450-46（4）与其他方法联合定性

TLC-MS联用仪：

27一月202450-47定量分析：半定量和定量半定量方法：估计含量，如限量检查；定量方法：间接定量——

洗脱测定直接定量——

薄层扫描测定：主要包括吸收扫描法和荧光扫描法五、定量分析27一月202450-481、薄层扫描定量分析的基本原理（1）薄层吸收扫描法的原理：郎伯比耳定律

透射比反射线性关系好27一月202450-49（2）薄层荧光扫描法的基本原理：

φ为效率常数；a为吸光系数；b为薄层斑点厚度27一月202450-502、薄层色谱扫描法定量分析方法（1）外标法①外标一点法：②外标二点法：27一月202450-51③回归方程计算法：27一月202450-52（2）内标法27一月202450-53（3）归一化法采用该方法的条件是：被分析的各个组分在分子量、吸收系数等性质上差别较小，组分斑点的面积均在线性范围内，样品中所有组分均被分离且被有效扫描。27一月202450-541、薄层色谱扫描仪的基本构成主机（硬件）：主机部分与分光光度计类似，由光源、分光系统、薄层板放置仓（相当于样品池）、检测器等数据处理与信号输出系统（软件）等部分组成。六、薄层色谱扫描仪27一月202450-552、薄层色谱仪的扫描方法扫描方法：一般采用双波长测定，可用反射法或透射法得到信号。扫描方式：线形、齿形、环形扫描，多通道扫描等六、薄层色谱扫描仪27一月202450-56薄层色谱扫描软件27一月202450-57七、薄层色谱法在药学领域的应用在中草药与中成药分析中的应用中药材的品种鉴别中成药的鉴别中药薄层指纹图谱鉴别中草药成分分析中成药的含量测定及质量标准研究等薄层色谱法在合成药物分析中的应用药典仅限于合成药的定性鉴别和纯度检查2010中国药典二部采用TLC进行鉴别和纯度检查的品种数量共435个（约占收载总数的19%）也用于含量测定、稳定性考察、体内药物测定及代谢研究、生化药物及抗菌素分析等。27一月202450-58专属性较强的薄层色谱鉴别技术在2005年版《中国药