RBL-2H3肥大细胞RTCA评价中药注射剂类过敏反应操作规程

1T/TPPAXXX-2022本文件规定了RBL-2H3肥大细胞RTCA法评价中药注射剂类过敏反应操作规程。本文件适用于所有中药注射剂。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14925-2010实验动物、环境及设施GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义3.1RTCA中文：实时细胞分析。英文：Real-timecellanalysis，RTCA。3.2细胞指数：CI中文：细胞指数。英文：Cellindex。3.3C48/80中文：化合物48/80。英文：Compound48/80。4检测原理RBL-2H3细胞易被体外培养，易获得多批次同性质细胞；其胞质内含有大量的嗜碱性颗粒，且细胞表面包含大量高亲和力IgE受体，能特异性的结合IgE，导致细胞致敏态，当细胞与相应的抗原结合后，引起细胞膜的稳定性下降，通透性增强，分泌性颗粒由胞内的分泌到胞外，此谓脱颗粒，随之释放许多生物活性介质如组胺、β-氨基己糖苷酶、以及相应细胞因子，介导过敏/类过敏反应的发生。因而无论是I型过敏或类过敏反应都可通过检测RBL-2H3细胞脱颗粒后释放的炎症介质或其信号分子来检测过敏程度，用于评价药物是否有致敏性，进一步评价药物的致敏类型及致敏程度。故RBL-2H3细胞是建立体外检测脱颗2T/TPPAXXX-2022粒反应的优选模型。RTCA包括由分析软件，16孔金电极板、电极槽及分析系统组成的实时、连续、定量跟踪细胞增殖分化改变的细胞阻抗传感器。电极板依据电阻显示实验结果，细胞接种于电极板，通过检测实时传感器表面的电阻抗信号，测量的电阻来持续监控细胞，电阻传感器平铺于金电极板的底层，覆盖了每孔3/4的底面积，对活细胞的检测灵敏度很高。通过实时地检测传感器表面细胞的电阻抗信号来持续监控细胞反应。可对细胞进行实时监测，能反映细胞增殖、存活、形态变化等细胞生物学状态。可实时定量地来测量加药后RBL-2H3细胞状态（包括细胞数量、粘附、活力和形态）的改变，并提供精确的定量信息，全程实时连续动态监控。细胞的动态变化作用于电极板引起电阻值连续的变化，实验结果根据实时测得的电阻值换算为细胞指数（CellIndex,CI）作为指标，通过CI曲线上升及下降等变化趋势表示电极板中细胞的变化。电阻的大小由三个因素决定:每孔里的细胞数量、细胞和细胞的相互作用或细胞与电极板的相互作用的结果和细胞的形态以及骨架变化。在同样细胞数量以及同样的环境条件下，越多细胞粘附于电极板上或者细胞形态延展的面积越大，电阻值升高，细胞指数越大，反之细胞凋亡脱落，电阻值下降，细胞指数降低。RTCA系统利用电阻数值换算为细胞指数(CI)作为实验读数指标，简洁直观，细胞动态变化引起的电阻值变化由CI曲线来表示，实时检测细胞变化并绘制出细胞的实时特征曲线。实验结果中的曲线图，通过曲线的上升，平台期以及下降表示了电极板中细胞的状态。IgE介导的肥大细胞激活不仅导致明显的细胞形态改变，而且会引起细胞黏附能力增加，这两者在RTCA系统中都会引起CI值的上升。5试验方法5.1试验材料5.1.1细胞系RBL-2H3细胞来源于美国ATCC(AmerieanTpyeCultureColleetion)，购自中国科学院上海细胞研究所。也可来源于其他正规科学院所。5.1.2主要试剂和配制常规细胞培养所用试剂，如DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、KCl、NaCl、Na2HP04·12H2O、KH2P04、NaHC03、CaCl2、MgSO4、Co(NO3)2·6H2O、(NH4)SH等无机试剂、Compound48/80（一般为Sigma公司产品）、DMSO、L-谷胺酰胺、青霉素-链霉素。5.1.3主要仪器5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、实时细胞分析系统RTCA系统、16孔电极板（美3T/TPPAXXX-2022国罗氏公司）、生物洁净工作台、离心机、水浴锅、超纯水装置、高压灭菌器、－80℃低温冰箱等。5.1.4试剂的配制（1）D-Hanks平衡盐溶液的配制：称取KCl：0.40g，NaCl：8.00g，Na2HPO4•12H2O：0.134g，KH2PO4：0.06g，NaHCO3：0.35g。将以上物质溶于100mL的超纯水中，将配好的溶液移入1L容量瓶中，加入超纯水临近1L刻度线。D-Hanks平衡盐溶液过滤前调节pH为7.2-7.4，用超纯水定容。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃环境中。（2）DMEM完全培养基的配制：DMEM基础培养基85ml，胎牛血清15ml，配置成含15%胎牛血清，l00U/mL青霉素以及l00U/ml链霉素，和l00U/mL的谷氨酰胺，加工成DMEM完全培养基，4℃保存备用。（3）PBS缓冲液的配制：称取NaCl：8g，Na2HPO4•12H2O：3.23g，NaH2PO4•12H2O：0.45g。将上述药品溶于1L的蒸馏水中，调节pH为7.2-7.4。5.2试验方法5.2.1细胞培养RBL-2H3细胞培养于含15%胎牛血清的DMEM培养基中，放置于37℃,饱和湿度，5%CO2培养箱中。RBL-2H3细胞为贴壁生长。观察细胞的生长状态，如果细胞没有长到90%密度，则换液。1-2天后，等到细胞生长到90%密度时，就可以传代或者冻存。5.2.2细胞传代(1)当细胞生长铺满约90%培养瓶底面积时，可进行传代。培养瓶从CO2培养箱中取出，吸去培养瓶内的培养液，D-hanks清洗2-3遍，然后每瓶加入2ml的0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液，培养箱中孵育1-2min左右。(2)镜下观察细胞间有明显的间隙，一旦细胞变圆，用手拍瓶壁，敲脱细胞。(3)迅速加入用2ml含10%血清的培养液中止消化液作用，轻柔吹打，将细胞收集于离心管中。800rpm离心5分钟，弃上清液。(4)计数细胞，以1:3进行传代培养。一般4天传代一次。5.2.3细胞冻存(1)首先按照传代方法将RBL-2H3细胞消化下来。(2)配制细胞冻存液:10%DMSO+90%胎牛血清。(3)向离心好的细胞中逐滴添加冻存液，并不断混匀。4T/TPPAXXX-2022(4)将全部细胞悬液以每个冻存管中lml的容量转移到冻存管中，一般密度大约为1×106个/管。(5)冻存好的细胞做好明确的标记，包括时间，冻存人，冻存代数，细胞类型等，放置于-80℃冰箱，长期保存。5.2.4细胞复苏(1)从-80℃冰箱取出己经冻存的RBL-2H3细胞，37℃水浴快速振荡复苏。(2)融化至只有小块冰核时，从水浴中取出冻存管。(3)用95%酒精漂洗冻存管，将冻存液逐滴添加到5mlDMEM培养液中，轻柔地上下吹打，混匀。(4)800rpm离心5分钟，弃去上清，用DMEM培养基重悬细胞，接入培养瓶中。5.3RTCA检测5.3.1E-Plate16准备（1）在E-Plate16的孔中加入50µl培养基。(2)将E-Plate16放到RTCAStation上。(3)RTCA系统会自动进行扫描（“ScanPlate”）->检查是否接触良好（在“Message”页面显示ConnectionOK）。(4)开始检测基线（Background）15min,确定所选择的孔接触正常，所有孔的CellIndex低于0,063。(5)取出E-Plate16，在孔中加入100µl混合均匀的RBL-2H3细胞悬液，使每孔中细胞数目为5,000cells/100µl。(6)将E-Plate16放到培养箱中的RTCAStation上。(7)在系统自动扫描“ScanPlate”后，开始Step2。（8）RTCA程序设置如下：11（9）RTCA数据分析通过NormalizedCellIndex得到的Plot图，可以得到每组的每个孔每个时间点的CI值，右键导出图片、数值、实验分组等数据。5.3.2细胞接种浓度的确定5T/TPPAXXX-2022RTCA检测工作台放在二氧化碳细胞培养箱中（5%CO2，37℃)。按倍比稀释的浓度细胞接种于16孔细胞检测板中，使细胞贴附于电子传感器表面。另设对照组，只添加培养基而不接种细胞。5.3.3CI值曲线接种细胞后，细胞电极板将实时定量地提供细胞的生物学状态，通过底部电极收集细胞电阻信号，最后转化为细胞指数(CI)。于RTCA检测工作台上，与分析仪和实时细胞分析系统控制台接通，设置监测间隔为15min，监测48h。通过RTCA系统实时监测细胞状态的变化，并绘制出RBL-2H3细胞的实时特征CI值曲线。不同样品的CI值曲线可能不同。5.3.4供试品检测RBL-2H3细胞以7.5×104ml的细胞浓度接种于16孔细胞电极板，每孔100μl，监测24小时，待细胞增长稳定后，设空白对照组和加药组，空白对照组加入完全培养基50μl，加药组加入不同浓度的配制好的供试品药液各50μl，于RTCA检测工作台上，与分析仪和实时细胞分析系统控制台接通，设置监测间隔为5min，监测1.5h。通过RTCA系统实时监测细胞状态的变化，并绘制出RBL-2H3细胞的实时特征CI值曲线。5.3.5Compound48/80对RBL-2H3细胞脱颗粒的作用RBL-2H3细胞以7.5×104/ml的细胞浓度接种于16孔细胞电极板，每孔100μl，监测24小时，待细胞增长稳定后，设对照组和Compound48/80（20μg/ml）组，于RTCA检测工作台上，与分析仪和RTCA系统控制台接通，设置监测间隔为2min，监测48h。通过RTCA系统实时监测细胞状态的变化，并绘制出RBL-2H3细胞的实时特征CI值曲线，观察供试品药液对RBL-2H3细胞脱颗粒的量效关系和对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响。6结果计算对实验数据进行统计学分析，实验数据以CI值先上升后下降时候的最高点=x±s，各给药组与阴性对照组比较，r＜0.05表示为存在显著性差异，即CI值最高点越高，表示RBL-2H3细胞出现脱颗粒现象越严重，认为有类过敏发生的风险。7其他7.1适宜细胞浓度的确定RTCA系统可用来定量和动态地监测细胞增殖情况。每种细胞都有独特的增殖曲线，增殖曲线决定细胞的接种密度。这个独特的生长曲线可作为细胞系质量控制的标准，来确保同一实验和不同实验间的一致性。6T/TPPAXXX-2022RTCA系统实时检测细胞增殖情况48h后，可观察到不同密度接种的RBL-2H3细胞均有不同的生长曲线，同时对应不同的CI值。CI值依赖于接种于电极板的细胞浓度，不同浓度细胞的CI值从0.3到1.4不等。不同实验室应根据试验的情况摸索不同的细胞浓度。不同实验室应根据试验的情况摸索不同的细胞浓度和CI值。7.2供试品量效关系摸索至少应考察3~5个供试品不同浓度，考察供试品对RBL-2H3细胞无明显抑制或促进的浓度，最终选择安全的最大剂量作为考察该药品的安全浓度。7.3供试品对RBL-2H3