第五章 动物细胞染色体工程

下篇：动物细胞工程实践之Ⅱ第五章动物细胞染色体工程本章主要内容5.1自然界的多倍表达象多倍体、体细胞多倍体及由配子形成的多倍体、多倍体分类5.2人工诱导多倍体动物***人工诱导多倍体的机制、诱导多倍体动物的方法5.3单性生殖与人工诱导雌、雄核发育***高等动物的单性生殖、卵母细胞孤雌激活的机理、Hertwig效应5.4动物染色体结构的改造5.5人工染色体酵母人工染色体、细菌人工染色体、哺乳类人工染色体理论根底：细胞遗传学植物(Plant)物种染色体数目〔2n=〕人46小白鼠40非洲爪蟾36蛙26果蝇8线虫2家蚕56猪38马64牛60绵羊54鸡78物种染色体数目〔2n=〕拟南芥10水稻24普通小麦42大麦14玉米20烟草48陆地棉52大豆40西瓜22动植物染色体数动物〔Animal〕2个5.1自然界的多倍表达象(1)多倍体〔Polyploid〕--指个体每个细胞中含有3个或3个以上的染色体组〔genome〕染色体组：指配子中所包含的染色体或基因的总和。单倍体：体细胞中含有本物种配子的染色体数目的个体。根据细胞中染色体组数目的不同称为三倍体(tripliod)、四倍体〔tetrapliod〕、五倍体〔pentapliod〕等。5.1.1概念为什么植物中多倍体较多、动物中较少？--是进化的结果，是生活方式的反响。---植物:固着为生，必须耐受极端环境的改变，染色体多能增加遗传的表型易变性。---动物:可动，能避开恶劣环境生存。多倍体多见于高等植物,如小麦、棉花、烟草、苹果、梨等，动物少见。(2)动物中的天然多倍体早先以为几乎所有动物都是二倍体。在20世纪60年代发现一种美洲角蛙是四倍体。之后,在低等脊椎动物包括鱼类、两栖类和爬行类中也有发现；鱼类多倍体相对较多，虹鳟、鲤鱼、泥鳅和鲫鱼(Carassiusauratus)等就是天然多倍体。在人类也发现有三倍体。人类三倍体问题

有人曾报道了230例三倍体流产胎儿和33例产后幸存的三倍体婴儿临床资料。发现，三倍体胎儿都是二倍体和三倍体的“嵌合体〞。一例三倍体婴儿，小头、并指、迟钝，血细胞培养几乎完全是二倍体，但原皮培养中约92%的细胞是三倍体，其余8%是二倍体。产生原因：三种情况：2个精子入卵〔占66.4%〕；二倍体精子与单倍体的卵受精〔减数分裂过程中染色体未别离〔占23.6%〕；二倍体的卵与单倍体的精子受精〔10%〕。(3)体细胞多倍体、配子多倍体①体细胞形成多倍体原因:其一,成体体细胞在有丝分裂的过程中，染色体完成了复制，着丝点已分裂，但细胞受到外界环境条件(如温度骤变)或生物体内部因素的干扰，纺锤体形成受到破坏，以致染色体未被拉向两极，形成的染色体数目增加。如果这样的细胞继续进行正常的有丝分裂，就发育成染色体数目加倍的组织。第二,受精卵在分裂时，遇到特殊环境，会使整套染色体数目加倍。前者可造成躯体某局部的染色体数目加倍；后者可使发育的个体所有细胞中的染色体数目加倍。②由配子形成的多倍体。在配子形成减数分裂过程中，染色体没有减半，就会产生染色体数目加倍的配子。染色体数目加倍的配子在受精以后会发育成多倍体。因此，多倍体可以发生在个体发育的不同阶段：或配子期、或卵裂期、或体细胞分裂期。①同源多倍体:--系指来源于同一个物种的二倍体以上的个体。成因：第一，有丝分裂异常。体细胞：在有丝分裂过程中染色体分裂而细胞不分裂，使“2n〞变成“4n〞。第二，减数分裂异常。配子：性细胞在减数分裂过程中染色体未发生别离，形成的配子仍是二倍体。如果2nX2n→4n；如果2nX1n→3n。②异源多倍体：---系指来源于不同的种间或属间物种杂交产生的染色体数大于二倍体的个体。--成因：先通过种间或远缘杂交，再经染色体加倍而产生异源多倍体。(4)多倍体分类③异倍体/非整倍体--指某一个体在完整的正常染色体中缺失或额外增加个别染色体。如果配子第一次减数分裂不正常，第二次减数分裂正常，那么某对同源染色体就会不别离而同时进入一极。导致另一极中一个配子缺少一条同源染色体，从而形成n+1和n-1两种配子。如果第一次减数分裂正常，而在第二次减数分裂异常时，就会形成n+1、n-1和n三种配子。相互受精结果：♂〔n-1〕X♀〔n〕→个体〔2n-1〕；♂〔n+1〕X♀〔n〕→个体〔2n+1〕；♂〔n+1〕X♀〔n+1〕→个体〔2n+2〕。5.2人工诱导多倍体动物5.2.1人工诱导多倍体的机制(2)抑制第一极体的排放5.2.2诱导多倍体动物的方法(1)生物学方法：主要采用杂交方法，尤其通过种间杂交获得异源多倍体。刘思阳〔1987〕：用草鱼〔2n=48〕♀×♂三角鲂〔2n=48〕F1〔草鲂杂种三倍体3n=72〕[可见，雌性草鱼卵子第二极体的排放受到抑制。种间杂交抑制第二极体放出的机制尚不清楚，而种内杂交时，极少有不排出第二极体的现象发生]有三种：生物学方法、物理学方法、化学方法(2)物理学方法①温度休克法：冷休克法（0～5℃）热休克法（约30℃）－用略高于或略低于致死温度的冷或热休克法诱导形成3n〔抑制第二极体排放〕或抑制第一次卵裂形成4n。优点：廉价、易操作；常用。成功的关键：能否阻止第二极体的排出。需考虑三个因素：温度处理的开始时间〔TA，从受精开始算起〕、第二，处理持续时间〔D〕和处理时的水温〔T〕。影响因素很多，需要通过生物统计方法--正交试验、方差分析，以获得三因素组合的最正确值。②水静压法采用较高的水静压〔65kg/cm2〕抑制第二极体的排放或抑制受精卵第一次卵裂，产生多倍体。优点：诱导率高〔在90%～100%〕，处理时间短，对受精卵损伤小，成活率高。缺点：需专用设备如水压机，本钱较高，且处理卵的数量有限，不适于大规模生产。③高盐/高碱法

用高出常量浓度的盐或碱抑制第二极体的放出或受精卵第一次卵裂，产生三倍体或四倍体。(3)化学方法5.2.3多倍体倍性鉴定〔直接法、间接法〕(1)测量核体积。多倍体细胞及细胞核比二倍体稍大。鱼类，测量红血球的核体积之比值方法。2n:3n=1:1.5;2n:4n=1:1.74；(2)蛋白质电泳：血清蛋白，只对特定物种可用。(3)生化成分分析：三倍体具有较二倍体的红血球数量少，丙酮激酶活显著高于二倍体等。(4)染色体计数：准确，但费时。(5)DNA含量测定：流式细胞仪〔Flowcytometry〕简单、快速、准确测定出单细胞的DNA含量。5.3单性生殖与人工诱导的雌、雄核发育在生物的体细胞中，染色体的数目不仅可以成倍地增加，还可以成倍地减少。例如，蜜蜂的蜂王和工蜂的体细胞中有32条染色体〔受精的卵〕；而雄蜂的体细胞中只有16条染色体〔未受精的卵〕。单倍体：体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体叫做单倍体。工蜂蜂王孤雌生殖蜜蜂飞行中婚配最强壮的雄峰与蜂王交尾后死去蜂王获得终生享用的精子产卵受精卵雄峰（n=16）吃2-3天蜂王浆，经21天发育吃5天蜂王浆经16天发育幼蜂（2n=32）未受精卵图5-1蜜蜂的生活周期雌蜂〔n=32〕5.3.1人工诱导雌、雄核发育雌、雄核发育即单性发育。是通过人工控制产生的单性种群。意义；纯系建立、性别控制、遗传机制研究。①“赫特威氏效应〞--Hertwig效应Hertwig效应实验：②紫外线照射使染色体失活的机理-Hertwig效应原理紫外线与DNA作用时,在同一条多核苷酸链内相邻的胸腺嘧啶之间相互联结,形成了胸腺嘧啶二聚体(ThymineDimers)，此种二聚体阻止了DNA的复制,从而导致了精子遗传物质失活。紫外线照射可诱发突变和切断染色体,当照射量到达一定值以上,染色体断片脱落,精核萎缩,授精后虽然雄性原核化,但不能与雌核融合,不能正常发育。但可以激活雌核发育〔单倍体〕；如果雌核染色体加倍，就可形成正常二倍体动物。〔2〕雄核发育〔androgenesis)--将经紫外线、X射线或γ射线等处理卵子后，与正常精子受精，再在适当时间施以冷、热、高压等物理方法处理，使精子染色体加倍与卵子结合，发育成完全为父本性状的二倍体。人工诱导雄核发育研究较少。价值不大。5.3.3哺乳动物雌核发育--卵子的孤雌生殖(1)卵母细胞孤雌激活类型ABCC2C3图5-3卵母细胞的孤雌激活类型AuraniandKaufman19775.4动物染色体结构的改造通过染色体片段的删除和重排，产生携带特定染色体区片段缺失突变的动物，有助于在特定的染色体区实现系统的基因定位和功能分析。5.4.1染色体片段的删除和重排〔1〕放射线诱导发生染色体缺失突变〔2〕Cre2loxP介导染色体重组Cre重组酶是在噬菌体P1中发现的一个38kDa的蛋白质，其名称来源于causerecombination，它能识别34bp的特异序列〔loxP〕，介导两个loxP之间的序列发生重组，从而将两个loxP之间的序列删除，此过程不需要任何其他辅助因子的帮助。loxP的位置和方向不同，由Cre重组酶介导重组形成的产物亦不相同，导致染色体发生倒位、删除和易位等，从而实现染色体的定点操作。克服了用放射线诱导产生的突变不能定位的缺点，已被应用于果蝇、哺乳动物和植物染色体重组研究。通过小鼠染色体大片段的删除和重排可以产生一些人为可见的表型。－－主要建立疾病动物模型来模拟人类的某些疾病，为研究肿瘤抑制基因的识别和疾病的治疗诊断找到了捷径。染色体大片段的删除和重排的意义5.4.2染色体的易位〔translocation〕工程家蚕的性别控制与识别在实践和理论上的都有重要意义。通过建立性别标记的限性系统，可提高生产收益。性别标记的限性系统是指某一标记性状在雌、雄个体不同的遗传系统。雄蚕茧比雌蚕茧出丝率高20%以上，体质比雌蚕要强壮。养蚕生产上所用一代杂交种〔大体上是雌、雄各一半〕，如果全是雄蚕，那么既不用增加本钱，又不多费劳力就可以增加10%~15%的蚕丝。桑蚕中的W染色体具有决定雌性的绝对功能。在W染色体上，除有决定雌性的基因外，还没有发现能表现其它性状的基因，但人们可以利用χ、γ等物理射线的照射处理，能使带有标志基因的某个染色体片段易位到W染色体上，从而获得好几种限性遗传的类型.近些年来，运用辐射诱变和染色体工程手段先后培育出有性别标记的限性蚕品种。目前生产上可利用的有卵色限性系，斑纹限性系和茧色限性系，卵色限性系已建立了一个较为完整的系统。图２ＣＴＰＹИИИＫＯＢ的卵色限性系统

说明：ω２、ｗ3分别为第二白卵基因、第三白卵基因，+ω２、+ω3．分别为ω２、ω3的等位基因〔显性〕，＋ω２、＋ω3，同时存在表现黑卵。载有ω２、ｗ3、+ω２、+ω3的是第10染色体。上世纪70年代ＣＴＰＹИИИＫＯＢ用辐射诱发了两个第10染色体向ω染色体易位的品系，其中一个在易位的第10染色体片段中含有白卵基因ω3,另一个含有白卵基因ω２。由于+ω２与+ω3有互补作用，只有同时存在才表现黑卵，隐性ω２或ω3只要任何一个成纯合型时，便表现白卵。这种易位雌体各同持有ω２／ω２或ω3／ω3的雄交配，分别得到黑色雌卵与白色雄卵，表现卵色限性遗传。当这两个品系互交时，就得到黑色雄卵和白色雌卵。采用这样的品种进行原种繁育时，可由光电选卵机多项选择黑卵雌蚕饲养，能提高制种能力、降低生产本钱。农村养蚕用两系的正反杂交F可选黑卵雄蚕饲养，以提高出丝率。蚕卵色限性系统5.5人工染色体染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配，它需要3个关键序列：其一，自主复制DNA序列〔autonomouslyreplicatingsequenceARS〕：是DNA复制的起点，确保染色体能够开始自我复制。其二，着丝粒DNA序列〔centromereDNAsequenceCEN〕：确保染色体在细胞分裂时能平均分配到子细胞中。其三，端粒DNA序列〔telomereDNAsequenceTEL〕：使DNA能结束复制，确保染色体的独立性和稳定性。将自主复制DNA序列、着丝粒DNA序列和端粒DNA序列这3个关键序列组装拼接后就得到人造微小染色体〔artificialminichromosome〕。应用：在大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定等研究中得到了广泛的应用，具有极为重要的价值。人造微小染色体的制备与应用目前正在研究或应用的人工染色体①酵母人工染色体〔yeastartificialchromosomeYAC〕、②细菌人工染色体〔bacterialartificialchromosomeBAC〕③哺乳动物人工染色体〔mammalianartificialchromosomeMAC〕。Fig.5-5人造基因5.5.1酵母人工染色体〔YAC〕1983年，Murray等人首次成功构建了包括着丝粒、端粒、复制子和外源DNA总长度为55kb的酵母人工染色体。1987年，Burke等人构建了能克隆大片段人体DNA分子的载体YAC。证明YAC可用来构建高等生物的完整基因组文库，克隆容量达100～1000Kb。图5-3YAC的构建自主复制序列色氨酸合成基因pYAC〔YAC质粒〕长约8kb，带有人工染色体所需的一切元件。当要用它进行克隆时，先用BamHI和SmaI对它进行双酶解，回收两个臂，然后平末端的外源大片段DNA就可以两个臂连接，形成真正意义上的人工染色体。色氨酸合成基因酵母菌着丝粒序列端粒复制原点酵母人工染色体的构建与其他克隆载体的构建程序相似：第一，包括大片段DNA的获取；第二，YAC重组体的构建；第三，YAC重组体对酵母的转化；第四，YAC基因库的鉴定；第五，目的基因YAC克隆的筛选；第六，目的基因YAC克隆的鉴定。YAC存在一些缺点：YAC是目前容量最大的载体，但存在一些缺点：--①插入片段大，稳定性较差；--②插入的大片段易发生缺失，使文库不完整；--③插入片段易发生重排，造成序列错误；--④DNA片段来自两个或两个以上的染色体，使文库中的嵌合现象