遗传育种学课件：转基因与生物安全性

转基因与生物安全性转基因与生物安全性第一节 概述第二节 转基因技术的原理与方法第三节

外源基因整合、表达与遗传第四节 转基因水产动物的安全性第一节

概述转基因技术的发展1982年，美Richard

D.

Palmiter等首次将大鼠生长激素（GH）基因导入小鼠受精卵中，获得了个体比大鼠大1倍的转基因“超级鼠”，此后，转基因技术得以飞速发展。第一节

概述转基因通常是指在DNA操作过程中整合到动、植物受体细胞染色体上的外源基因。转基因技术为了能够使外源基因在动、植物体内稳定展现出相应的生物学表型，必须采用转基因的重组子构建技术、重组分子导入动植物体内的转化技术、转基因在受体细胞染色体上的稳定整合及可控表达技术，这些技术统称为转基因技术。第一节

概述转基因技术在水产动物育种上的应用1984年朱作言等将小鼠重金属螯合蛋白基因启动子与调控序列和人生长激素基因的重组DNA注射到鱼受精卵原核内，培育出生长速度快的转基因鱼，证明了外源基因可在受体鱼内整合、表达、促生长，并通过性腺传递给子代，建立了世界上首例转基因鱼模型。第一节

概述转基因技术在水产动物育种上的应用快速育种传统的品种选育需经过多代反复选种交配才能育成优良品种。转基因技术可能在很短时间内超越自然界亿万年生物进化历程，创造自然界原来没有的品种或品系；改良养殖性能加快受体生长、提高饵料利用率及抗逆性等。转基因鱼生长速度可提高11%～30%，即

“超级鱼”

。第一节

概述转基因技术在水产动物育种上的应用生产医药生物制品利用海水养殖生物生产基因工程口服药物和疫苗，既能利用海洋生物量大、生产成本低的特点，又能避免表达后提取、纯化的复杂性（携带人胰岛素的转基因鱼以提供胰岛素）；转基因鱼的育性控制不育的转基因鱼或雌核发育转基因鱼，是解决转基因鱼进入天然水域后对同类或可交配的近亲种类的遗传背景产生影响和干扰的好办法第二节 转基因技术的原理与方法外源基因的表达和检测外源基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞转基因的主要技术外源基因的构建第二节 转基因技术的原理与方法一、外源基因的构建外源基因启动子目的基因转录终止信号(一)、启动子病毒基因启动子: 猴空泡病毒启动子（SV40）和禽肉瘤病毒启动子（RSV）高等动物启动子和增强子：如小鼠金属硫蛋白基因启动子（mMT）鱼类基因启动子：

如β肌动蛋白（β-actin）基因启动子、抗冻蛋白启动子（AFP）、鲤金属硫蛋白基因启动子(二)、目的基因目的基因生长激素(GH)基因增加抗逆性的基因抗冻蛋白(AFP)基因抗病性基因珠蛋白基因报告基因(二)、目的基因生长激素（GH）基因鱼类转基因研究的第一个热点：①

获得生长快、产量高的“超级鱼”；②

对各种动物和人的生长激素及其基因序列都已研究清楚，并且用DNA重组技术构建了许多含mMT启动子和生长激素基因的质粒，为各种动物转基因研究和实践准备了现成的材料；③

很多实验都证明哺乳类和鱼类的生长激素注射到鱼体后，不仅能产生明显的促生长作用，而且还能提高某些鱼类对水体盐度的适应力和饲料转换系数。(二)、目的基因生长激素（GH）基因第一代转基因鱼：哺乳类或家畜的生长激素基因远源基因存在着在受体鱼细胞中的表达调控与生物学效应以及转基因鱼消费安全等问题第二代转基因鱼：“全鱼”基因、“自源基因”

(autotransgenic)除安全性外，“全鱼”结构还可提高转移基因的表达水平(二)、目的基因转生长激素（GH）基因实例Du（1992

）用美洲大绵鳚启动子opAFP和大鳞大麻哈鱼GH基因构成的融合基因转移到大西洋鲑受精卵中，获得转基因鱼个体的体重比对照组平均要大3.8倍，标志着第二代转基因鱼的诞生；最戏剧性的转生长激素基因“超鱼”来自Devlin

等(1994,Nature

371)

的报道,结果表明转生长激素基因鱼平均体重比对照平均体重高11

倍,

最大个体体重比对照最大个体体重大37

倍。(二)、目的基因转生长激素（GH）基因实例虹鳟:

Robert

H.Devlin,

2001,Nature(二)、目的基因抗冻蛋白(AFP)基因鱼类转基因研究的第二个热点：抗冻蛋白（anti-freeze

proteins,

AFP）具有降低胞内溶液凝固点的作用，存在于美洲黄盖鲽等寒冷水域的鱼体内；把AFP基因转移到缺乏该基因的鱼（各种热带经济鱼类如罗非鱼等）中，以提高这些鱼类的抗寒能力，从而扩大这些鱼类的养殖地域及节省越冬期间的能量消耗，为水产养殖提供新的品质优良的品种。(二)、目的基因抗冻蛋白(AFP)基因目前已从美洲拟鲽、黄盖鲽、瓦氏雅罗鱼等鱼类中分离并克隆出AFP基因。转抗冻蛋白基因金鱼：纽芬兰大洋条鳕AFP基因注入金鱼受精卵中；转抗冻蛋白基因鲫鱼：美洲大绵鳚AFP基因转入鲫鱼(二)、目的基因抗病性基因抗微生物成分基因如转昆虫抗菌肽、溶菌酶等用于转基因研究；转抗菌肽Cecropin

B基因的斑点叉尾鮰、斑马鱼与对照鱼相比均显示具有较强的抗病原菌的能力；转鸡溶菌酶基因的斑马鱼F2的溶菌活力是对照鱼的1.75倍(二)、目的基因报告基因（reporter

gene）所谓报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个表达产物非常容易被鉴定的基因。如氯霉素乙酰转移酶基因CAT，荧光素酶基因luc

，绿色荧光蛋白GFP基因(二)、目的基因报告基因（reporter

gene）因为报告基因的表达易于量化和定位，主要用来研究外源基因在受体水产动物，尤其是在模式水产动物中的整合和表达，对外源基因在转基因水产动物中的行为并进行理论上的探讨。某些报告基因不但可以用于监控转基因及其表达，还可用于新型观赏鱼的开发

。(二)、目的基因报告基因（reporter

gene）转荧光蛋白基因斑马鱼作为观赏鱼已于2004年初在美国（除加洲外）市场上销售，转荧光蛋白基因斑马鱼成为第一种上市的转基因动物二、

外源基因的导入显微注射法电穿孔法精子载体法脂质体法逆转录病毒转染基因枪法I. 显微注射法借助于显微镜的放大技术，直接把外源基因注射到动物的卵母细胞、受精卵、早期胚胎、胚胎干细胞或体细胞中，然后生产动物个体的方法。优点：整合率高缺点：设备昂贵、操作技术难度大，每次注射有限细胞I. 显微注射法II. 电穿孔法在瞬间高压下，细胞膜形成可逆的细胞膜孔，DNA经由细胞膜孔而进入细胞中，当电场消逝后细胞膜可在回复，使DNA保留在细胞内优点：可一次处理大量样品缺点：高压易使受精卵受到伤害；导入是随机的、无定向性，而且转移率较低。III. 精子载体法spermmediatedgene

transfer将目的基因利用电穿孔方式送入精子，而后再利用体外受精的方式使精子与卵结合，通过重组作用使遗传物质繁衍至下一代III. 精子载体法spermmediatedgene

transfer利用精子携带电脉冲法对大珠母贝和合浦珠母贝进行了转基因研究，阳性率达50%；聚乙烯亚胺(PEI)与精子载体法相结合在将外源基因转入皱纹盘鲍；Tsai等用电脉冲介导的精子载体法将外源基因(opAFP2000CAT)

导入杂色鲍中，阳性率达65%IV. 脂质体法

lipofection脂质体:

人造脂质小泡，在水中磷脂分子亲水头部插入水中，疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，可将外源DNA包装在内部，通过双层膜同受体细胞膜间的融合作用，使外源DNA进入细胞质，再进入细胞核，完成基因转移IV. 脂质体法

lipofection优点：操作简单方便缺点：要多次重复测试才能找到最适宜转染条件V. 逆转录病毒转染Virusmediatedgene

transfer病毒具感染宿主细胞能力，可将目的基因嵌入适当病毒载体中；此载体在感染细胞或胚胎时，将外源基因带入基因组中优点：操作简单，一次可处理众多样品缺点：外源基因在生殖细胞系中的遗传率低于显微注射VI.

基因枪Gunpowder将包裹DNA的金粒或钨粒，通过基因枪（火药爆炸或高压气体加速）、氦气或电击等技术来获得足够的加速度，射入完整的植株、组织外植体、愈伤组织或细胞悬液高效，但是整合率非常低VI.

基因枪Gunpowder刘志毅等（2001）:含猿猴空泡病毒启动子、绿色荧光蛋白基因(GFP)和核酶基因的质粒pGTR导入虾卵，通过显微荧光观察和RT-PCR检测，得到了转GFP基因的中国对虾幼体第三节 外源基因整合、表达与遗传一、外源基因整合（一）外源基因的命运一般在胚胎发育早期受体细胞内进行大量的复制，复制以后经历部分降解、变构、多聚化和逐渐与基因组整合的过程。整合：有效整合，无效整合或沉默表达，毒性整合第三节 外源基因整合、表达与遗传一、外源基因整合（二）随机整合外源DNA引入细胞基因组，绝大多数情况下发生DNA随机整合，是一种非常规重组；一、外源基因整合（二）随机整合

外源DNA整合的构型“循环排列线状”分子模型：DNA分子的环化；环化分子的随机切开；形成一系列循环排列的线状分子；同源交换，形成串联结构一、外源基因整合（二）随机整合整合效率外源基因注入受精卵后可与受体基因组整合，整合率与受体鱼种类、注入方式、注入DNA的构型以及剂量有关。整合特点通常插入染色体的一个位点，少数情况插入几个位点；形成转基因嵌合体（占65%）；整合的随机性和拷贝数的变异性。一、外源基因整合（三）同源重组（基因打靶）通过外源DNA与靶位点上相同核苷酸序列的同源重组，使外源基因稳定地插入预定的位点。GeneknockinGeneknock

out通过基因打靶技术，在胚胎干细胞上进行基因转移、筛选，克隆稳定整合的细胞，以此细胞再作核移植，有望获得遗传稳定的转基因鱼，从根本上解决转基因的定点整合与可控表达。二、外源基因的表达整合位置不同,

转入基因有不同的表达：如整合在封闭的染色质区很少或几乎不表达；若整合在活化的染色质区域，可能会高效表达；整合的转入基因拷贝数的不同也能使转基因表达水平不同导入基因的不确定性与遗传的不可预见性：受体中整合的量及部位不同，又缺少调控手段，外源基因在受体中的表达也是不确定的；产出的转基因鱼畸形多，在其后代中具有的外源基因拷贝数目也不一样，发生分离，优良性状不能稳定遗传，转基因表达具有不可预见性第三节 外源基因整合、表达与遗传目前，国内外已克隆出20多种鱼的GH基因，构建出10多个“全鱼”重组基因模型；转基因遗传不稳定问题: 基因打靶+克隆+核移植，获得遗传稳定的转基因鱼；定点整合、稳定遗传、稳定与可控表达以及安全性问题，仍是今后相当长一段时间内转基因技术研究的重点、难点和热点问题转基因技术与传统技术传统技术转基因技术相同本质都是通过获得优良基因进行遗传改良区别在生物种内个体间的基因转移不受生物体间亲缘关系的限制整个基因组的操作和转移明确定义的基因的转移第四节

转基因水产动物的安全性一、转基因技术的发展1、在全球1983年世界上第一例转基因植物—一种含有抗生素药类抗体的烟草在美国成功培植；1993年世界上第一种转基因食品—转基因晚熟西红柿正式投放美国市场；2009

年，25

个国家的1400

万农民种植了1.34

亿公顷（3.3亿英亩）转基因作物，相比2008

年1330

万农民种植1.25

亿公顷有所上升（7%）。一、转基因技术的发展一、转基因技术的发展农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）执行纲要简报一、转基因技术的发展1996-2009年，种植转基因作物的国家由6个增加到25个。一、转基因技术的发展2、在中国2009年，种植面积突破370万公顷，成为继美国、阿根廷、巴西、印度、加拿大之后的转基因作物种植大国。正在研究的转基因生物有130多种，涉及的基因种类超过100种。1993年，发布了基因工程安全管理相关法规。2001年，国务院发布了《农业转基因生物安全管理条例》一、转基因技术的发展2、在中国2009

年11

月：中国为转基因抗虫水稻（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室）和植酸酶玉米（中国农业科学院生物技术研究所）颁发了生物安全证书。二、转基因生物是柄“双刃剑”？对转基因作物的安全性争论，国际上有几个典型的事件。Pusztai事件；斑蝶事件；1995加拿大“转基因油菜超级杂草”事件；2001墨西哥玉米基因污染《农业转基因生物安全管理条例》，2001年5月9日实施。《农业转基因生物安全评估管理办法》，2002年3月20日起实施，第一次将转基因从低到高分为4个等级。《农业转基因生物进口安全管理办法》，2002年3月20日起实施。《农业转基因生物标识管理办法》，2002年3月20日起实施，规定对转基因产品实施标识制度。第一批标识管理的转基因生物目录是：大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕、玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉、油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕、棉花种子、番茄种子、鲜番茄、番茄酱。《转基因食品卫生管理办法》，2002年4月8日颁布，7月1日起实施。《进出境转基因产品检验检疫管理办法》，2004年6月12日颁布。三、转基因水产生物尚待解决的问题1、外源基因转移可控性和稳定的遗传性2、转基因鱼的安全评价受体鱼的安全性调查基因操作过程的安全性转基因动物的生态安全性遗传安全性食用安全性遗传和生态安全问题1）

转基因动物逃逸或释放到外界环境后，与野生物种进行交配，导致外源基因的扩散，改变物种原有的基因组成，造