资助类别亚类说明版面上项目proposal

国家自然科学基书（2015资助类别亚类说明附注说明项目名称依托单位通讯地址广州市越秀区沿江西路107邮国家自然科学基书（2015资助类别亚类说明附注说明项目名称依托单位通讯地址广州市越秀区沿江西路107邮政编码单位电话02084111595、电子邮箱申报日期2015年03月05版本第1 男 每年工作时间（月 广州市越秀区沿江西路107 版本第1 男 每年工作时间（月 广州市越秀区沿江西路107 StudyonFunctionofHedgehogsignalingpathwayduringliverregenerationanditspotentialapplicationinfutureclinic2016年012019年12liverregeneration;sub-acutehepaticinjury;Hedgehogsignalingpathway;hepatocytestransplant;fumarylacetoacetatehydrolase(Fah)版本第2版本第2模型，研究亚急性肝损伤引起的肝再生中Hedgehog(Hh)信号通路激活与增殖肝实质细胞在肝Liverregenerationistheprocessofliverreconstructionandrestorationaftervariousliverinjuriesinducedbymechanicaldamage,toxicationandvirusinfection.Recently,activationofHedgehog(Hh)pathwayhasbeenfoundduringpartialheptectomy-inducedliverregeneration.However,duetothelimitsofthismodelsystem,pathologicalinjury-inducedliverregenerationsarestillpoorlyunderstood.Inthisproposal,wewilluseFah-/-mouse,atyrosinimiarelativeliverinjury-inducedliverregenerationmodelsystem,tostudythefunctionofHhsignalingpathwayduringliverregenerationandtestitspotentialforfutureclinicapplication.Inpreliminarystudy,wehavefoundsomeuniquefeaturesofHhpathwayactivationduringliverrepopulationinFah-/-mouse.Inthisproject,weproposetheplanforcontinuedinvestigation;First,wewillbroadlystudythedetailsofactivationofHhsignalingpathwayduringtheprocessofliverrepopulationoftransplantedhepatocytesinFah-/-mouse.Second,wewillevaluatewhethertheinhibitorsofHhsignalingpathwaycanblocktheliverrepopulationofhepatocytesinFah-/-mouse.Finally,wewilltestwhethertheup-regulationofHhsignalingpathwaycanfurtherpromotetheliverregenerationinsub-acutehepaticinjury.Ourstudywillsupplynewinformationforapplicationofliverregenerationintofutureclinicandforfindingthetargetsofdruginscreeningtocontrolliverregeneration.项目组主要参与者（项目组主要参与者不包括项目申请人版本第392210041男0471-82男020-83男0471-94男020-5男0471-6男020-7项目组主要参与者（项目组主要参与者不包括项目申请人版本第392210041男0471-82男020-83男0471-94男020-5男0471-6男020-7男020-8男020-国家自然科学基金项目资金预算表（定额补助项目名称：Hedgehog版本第41/231456728394567国家自然科学基金项目资金预算表（定额补助项目名称：Hedgehog版本第41/23145672839456791011预算说明本项目申请经费80预算说明本项目申请经费8066.666713.3333（一）66.66671.：02.材料费：41.6667材料四：RNA-pulldown，0.5万元/个，需6个，共计3材料五：MagnaRIPTMRNA-BindingProteinImmunoprecipitationKit：材料七：购买普通shRNA0.3万元/份，需5份，共计1.5万元。材料九：SleepingBueaty试剂：1万元/份，需8份，共计8万元。材料十：LipofectamineTMRNAiMAX：0.4万元/份，需6份，共计2.4材料十二：实验动物BALB/c裸鼠0.01万元/只，需100只，共计1万元。其他：实验动物饲养费用0.0003元/只/天，共100只×100天，共计3万元。检测项目四：Deletionmapping，1万元/次，需5次，共计5差旅费：1.5万元。（参加肝再生学术交流会议6人次，每人次0.25万元，共计1.5万元0，约1万元专家咨询费：0.5万元。（研究期间邀请专家咨询，拟邀请5人次。专家咨询费1000元/天×1天×5人×1次=0.5万元11.：0（二）：13.3333版本第5（一）立项依据与研究内容（4000-字1（研究国内外研究现状及发展动态分析（一）立项依据与研究内容（4000-字1（研究国内外研究现状及发展动态分析献目录肝再生是肝脏损伤后肝内细胞增殖重建肝脏的过程。引起肝的损伤诱因是多方面的，包括肝脏的直接机械损伤，中毒、病毒侵以及各种肝脏疾病[1]。肝再生通过激活肝内细胞（包括肝实质细胞胆管上皮细胞、内皮细胞、枯否细胞等）增殖重建肝脏组织达到肝功能的恢复3]。因为肝再生与临床治疗紧密相关，对机理的深入研究，将有助于利用肝再生最终为临床的治疗服现有的对肝再生的认识建立在部分肝切除模型，人们在过去十年中对肝再生过程的机制进行了深入研究5]。近期指出[6]，Hedgehog(Hh)信号通路激活参与了在小鼠70％部分（PH）后肝脏再生过程（公认的成年人肝脏再生模型肝切除诱再生过程肝内Hh配体表达增Hh信号通路的成激活，体现在他们本身的表达加强，表达后活动加强。这个发现提了信号通路的激可能对肝再生的发生和调控起主导作用也进一步提示，对 信号通路的激活将有助于实现对肝再生的控[8]，从而有助于肝再生临床工作中的应用。然而，利用部分肝切除型研究所获得的结果得出的结论还没有证明具有普遍意义。这是因引起肝再生的损伤诱因是多方面括肝脏的直接机械损伤版本第6病毒侵染以及各种肝脏疾病。在基础研究中，针对肝损伤诱导肝再模拟的动物病毒侵染以及各种肝脏疾病。在基础研究中，针对肝损伤诱导肝再模拟的动物模型有几种类型部分肝切除模型只是其中的一种于研究肝切造成的肝损伤诱导再生的模型，是有局限性的。近期，应有其他的肝再生研究模型的研究中，我们发现了(Hh)号通路的激活在不同的研究模型诱发的肝再生中存在不同的激活因此(Hh)信号通路进一步广泛深入的研究，将获得(Hh)更加全面的认识，为临床应用打下良础肝再生动肝再生动物模型的不同，对肝再生机制的研究有重要影响肝再生研究中所运用的动物模型主要为啮齿类的大鼠和小鼠，根据发肝损伤的类型可划分为三类第一类：手术诱导肝损伤模型。主要通过部分肝切除、门静支结扎等方法诱导肝再生[10]。其中部分肝切除一直是肝再生主要的研究模型。该模型做为肝再生模型具有显著的优势：一、容操作，容易标准化，结果容易重复[11]；二、肝实质细胞增殖致，易于研究[9]；三、研究基础深厚。但值得注意的是，该模型依有诸多不足：一、肝再生过程快速启动并快速完成，有些信号转瞬逝，难以捕捉；二、理论上肝实质细胞仅需1.66次增殖即可完成生，而临床上肝再生往往需要肝实质细胞的连续大规模扩增；三、临床常见的肝再生情况不同，该模型无明显肝实质细胞的损伤，且余肝脏组织结构没有破坏，免疫系统参与较少9]版本第7第二物诱导肝损伤主要CCl4D-galactosamineacetaminophen、等药物引起肝损伤后诱导肝再生。药第二物诱导肝损伤主要CCl4D-galactosamineacetaminophen、等药物引起肝损伤后诱导肝再生。药物诱导的再生被认为与临床中常见的肝再生情况更为接近[9类模型往往于肝实质细胞的大量坏性粒巨噬细胞浸润清除死亡而剩余肝实质细胞连续大量增殖重建肝脏[12]。其肝再生过程更接疾病和中毒引起的肝损伤后肝再生过程。但这类模型非常依赖药物剂量、给药方式、动物年龄、营养状态、代谢酶活性等[13]。个异对实验结果影响巨大，导致这类模型难以标准化，实验结果较难复第三类：基因工程诱导肝损伤模型。主要有延胡索酰乙酰乙解酶缺失（Fah-/-）引起的肝实质细胞损伤动物，通过外源肝实质细移植实现肝再生本项目采用的（Fah-/-I酪氨酸血症模型[14]Fah基因缺失时，氨酸代谢通路的延胡索酰乙酰乙酸不能水解，使得有毒的代谢中间物延胡索酰乙酰乙酸和顺丁烯二酸单酰乙酰乙酸在肝实质细胞中大积累，导致肝实质细胞死亡，从而引起肝衰竭。Fah-/-小鼠比I酪氨酸血症患者有更严重的肝损伤，会导致小鼠出生后死亡。但治人I氨酸血症NTBC可阻断酪氨酸代谢通路。如小鼠喂食NTBC水，小鼠将正常存活[14]。一NTBC，Fah-/-将因肝衰竭死如果通过细胞移植方法将肝实质细胞移植小鼠肝脏中，同时撤NTBC，外源肝实质细胞将再生并重建小结构和功能[15]版本第8图1.Fah-/-小鼠作为肝实质细胞移植后再生模型。A.F图1.Fah-/-小鼠作为肝实质细胞移植后再生模型。A.Fah-/-小鼠酪氨酸代谢途径因Fah基因缺失被阻断。Maleylacetoacetate和Fumarylacetoacetate会引起肝实质细胞损伤并死亡。而NTBC可阻断酪氨酸代谢途径，防止产生有毒代谢中间产物。B.Fah-/-小鼠依赖NTBC存活。撤NTBC将导致小鼠因肝衰竭死NTBC的生，并重建肝脏的结构和功能Fah-/-小鼠模型是基于外源肝实质细胞在肝再生机制的作用下整合到受体小鼠肝脏中再植实现重建肝脏的结构和功能。因为肝实细胞Fah-/-小鼠中的再植集中反映肝再生中的肝实质细胞活动的全貌，结合该模型更接近临床病理情况的优点，和便于对肝实质细在再生中的定量分析的优点，我们在本研究中将能够以外源肝实质胞Fah-/-小鼠中的再植作为研究目标，把研究集中细胞的活动特点，以阐明通路促进肝实质细胞Fah-/-小鼠作为肝再生模型以下优势：一、易于操作，于标准化，结果容易重复；二、与疾病引起的肝损伤情况类似，更版本第9近临床；三、增殖的外源肝实质细胞与受损的肝实质细胞易于区分可通近临床；三、增殖的外源肝实质细胞与受损的肝实质细胞易于区分可通过细胞移植携带其他基因或shRNA等研究工具，方便研究肝实质细胞会连续发生大规模的肝再生过程长达数个星期易于捕捉肝再生不同阶段的事件。之前在肝切模型中，人们就发现胞外基质的降解与重建对肝再生有重要作用其调控过程非常迅速往往在几分钟内就能完成调控，使得对细胞外基质的研究十分困难而Fah-/-小鼠模型细胞外基质的调控过程长达数天甚至几个星期，得我们可以对其调控的机制进行深入研究[16]。Fah-/-小鼠世界上仅有少数实验室只有少数实验室建立了完整Fah-小鼠研究系统。人们对其肝再生的机制研究还比较少。我们实验室于申请人过去6年使用Fah-/-小鼠的研究经验，已经建立了完Fah-/-小鼠研究系统。我们准备充分发挥我们的优势进行研Hh信号通路在肝切损伤诱导出的肝再生的现有Hedgehog基因1980先由Nuslein-VolhardC在对筛选能引起果蝇突变的基因时发现[17]。哺乳动物中存在三个的同源基因：SonicHedgehog(SHH)、 Hedgehog(IHH)和Hedgehog(DHH)，分别编码Shh、Ihh和DhhHh白通过修饰才能获得完全功能Smoothened(Smo)及通路下游的类运动蛋白(Cos2)、丝氨白激酶(Fu)、Fu抑制剂(SuFu)、蛋白A(PKA)、Hedgehog用蛋白(Hhip),哺乳动物中Gli1、Gli2、Gli3等多种蛋白。Ptch是次跨膜蛋白,在人2个同源基因：Ptch1和Ptch2结合;Smo7膜蛋G偶联型受体同源,负责细胞内信版本10传导及靶基因的活Gli蛋白家族成员是较大的多功的转录因传导及靶基因的活Gli蛋白家族成员是较大的多功的转录因PKA起负调控Hhip是仅存在于脊椎动物体内高度保守的Hh相互作用蛋白,作为抑制因子Hhip能够Ptch的结合HhHh配体丧失Hh信号通路的功能[19肝再生过程是一个严格有序的过程。肝实质细胞的增殖和增肝实质细胞的有序构建肝组织使得肝再生过程严格受控，明显不同肝癌细胞在肝脏中成瘤生长[2,20,21]。在肝再生的过程中肝非细胞参与调控了对肝实质细胞调控[22]，最近的报道指出，成性肝损伤后出现刺猬（Hh）配体和发育形态发生因子的增加，这些子在胚胎发育过程中控制祖细胞分化和调节各方面组织生长[23]提示 信号通路也可能调节成年人肝脏再生。在小鼠肝切引起的再生模型中肝切除诱导肝细Hh配体增Hh信号通路。用定的 信号抑制剂干扰正常肝再生的几个关键组件，显著抑制了细胞反应、基质重塑、肝细胞胆管细胞增殖和肝体积恢复[24]脏再生的这些全面抑制作用显著降低小鼠肝切除后的生存率。所以节肝脏发育的机制如 通路的激活，将有可能维持和促进成人肝损伤后的肝再生，这是本课题申请的意义所在。为将来临床肝再碍性疾病（包括各种原因的肝硬化、肝切除后肝功能不全/种肝炎导致肝衰竭治疗提供试验在先期的研究中，应用外源肝实质细胞在Fah-/-小鼠模植作为研究目（见本课题申请研究基础部分我们的发现版本11前期报道中对(Hh)信号通路激活在作用于促进肝再作用，前期报道前期报道中对(Hh)信号通路激活在作用于促进肝再作用，前期报道认为Hh配体作为肌纤维母肝细胞的生长因子，刺激止期肝星状细胞获得肌纤维母细胞表型，并诱导未成熟胆管EMT[25]。因此，Hh通路的活化促进慢性肝损伤的纤维化修复反应不同于这个前期报道，我们研究团队认为，Hh通路激活能促进肝脏细胞的生长，有助于替换死亡的成熟肝细胞。我们的发现与最近的一篇报道的发现是吻合[23]3）Hh信号通路肝再生健康成人肝脏有巨大的再生能力。这使得人在接受70切除（PH）后数周内恢复正常的肝功能和肝质量。啮齿动物的肝再进行得更迅速，PH后7至10天就能完成肝脏所以啮齿动物经用来作为研究肝再生机制的实验模型。研究表明PH后的初始48细胞DNA合成剧烈增加，伴随（但高度显著）肝细胞有丝分裂和肝脏量的增加，所以认为PH后的肝再生很大程度上依赖于成熟肝细胞的加的复制28]。最近的研究已经证明，Hedgehog信号传导肝切除术后激活[7Hh体通常促进祖细胞的生长和存活，并出对人类和啮齿类动物的肝脏祖细胞有促进生长的功能，包括卵圆胞[29]。在胚胎发育和肿瘤转移过程中，Hh路的激活扩增基质细胞数量，通过保留现有间充质细胞原始的、迁徙的表型和在幼稚的上细胞中促进上皮－间质转变（EMT版本12既往的研究没有阐明Hh是如何释放出来的。即是什么细胞在除的再既往的研究没有阐明Hh是如何释放出来的。即是什么细胞在除的再生过程中释放了Hh在损伤后的肝否同样是这些细胞我们所利用的Fah基因敲除的肝损伤模型与肝切除模型相比有程度和损伤的时间可控制的优点，将利于我们研究操作后Hh释放胞。Hh作用于肝再生中的靶细胞，前期研究发表的结果提示可能的细胞为星型细胞的前体我们将首先观察在Fah损伤模型也是同样的细胞，下一步我们将深入研究Hh是否直接做用于肝实质胞上。这是因为Hh是刺激肝细胞数目的增多，有可能Hh直接作用实质上发挥促进实质细胞增殖的作用。在肝再生过程中细胞与细胞相互作用激活调控肝实质细胞的肝组织重建活动，已知的Hh信号参与肝再生的调控机理认识还没有真正搞清楚，现有的研究存在两最大的问题：I，本领域长期普遍认为，在急性肝损伤引起的肝再生程中主要活动是成熟的肝实质细胞的激活增值和组织构建然不能排除诱导和激活和肝内干细胞的分化增值，但肝内干细胞的活参与为非主要活动31]，而最新报道文章的观点却损伤引起的肝再生过程中星形细（HSC）干细胞被激活并分化为肝质细胞是主要的33]。II，先前的文章研究所用的肝性肝损伤引起的肝再生对于另外两类的肝再生模型中Hh的是否一尚待研究。为了研究这两个问题，我们在近期建立了与内蒙古大学欣教授的合作，并获得了充实前期的实验结果，为此基金的研究打了良好基础版本13Michalopoulos,G.K.,Liverregeneration.JournalofCellularPhysiology,2007.213(2):p.Michalopoulos,G.K.,Liverregeneration.JournalofCellularPhysiology,2007.213(2):p.Michalopoulos,G.K.andM.C.DeFrances,Liverregeneration.Science,1997.276(5309):p.DeLeve,L.D.,Liversinusoidalendothelialcellsandliverregeneration.JClinInvest,123(5):p.1861-Kuramitsu,K.,etal.,Carbonmonoxideenhancesearlyliverregenerationinmiceafterhepatectomy.Hepatology,2011.53(6):p.2016-26.Ogasawara,T.,etal.,BeneficialeffectsofKampomedicineInchin-ko-toonliverfunctionandregenerationafterhepatectomyinrats.HepatolRes,2008.38(8):p.818-24.Ochoa,B.,etal.,Hedgehogsignalingiscriticalfornormalliverregenerationafterpartialhepatectomyinmice.Hepatology,2010.51(5):p.1712-23.Hanaoka,J.,etal.,SignificanceofsonichedgehogsignalingaftermassivehepatectomyinaOmenetti,A.,etal.,Hedgehogsignalingintheliver.JHepatol,2011.54(2):p.366-Palmes,D.andH.U.Spiegel,Animalmodelsofliverregeneration.Biomaterials,2004.25(9):p.Mortensen,K.E.andA.Revhaug,Liverregenerationinsurgicalanimalmodels-ahistoricalperspectiveandclinicalimplications.EurSurgRes,2011.46(1):p.1-18.Gonzales,E.,etal.,ATPreleaseafterpartialhepatectomyregulatesliverregenerationintherat.JHepatol,2010.52(1):p.54-62.Michalopoulos,G.K.,LiverRegenerationafterPartialHepatectomyCriticalAnalysisofMechanisticDilemmas.AmericanJournalofPathology,2010.176(1):p.2-13.Diehl,A.M.,Nutrition,Hormones,Metabolism,andLiver-Regeneration.SeminarsinLiverDisease,1991.11(4):p.315-320.Grompe,M.,etal.,PharmacologicalCorrectionofNeonatalLethalHepatic-DysfunctioninaMurineModelofHereditaryTyrosinemiaType-I.NatureGenetics,1995.10(4):p.453-460.Huang,P.,etal.,Inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblastsbydefinedfactors.Nature,2011.475(7356):p.386-9.Mars,W.M.,etal.,Immediateearlydetectionofurokinasereceptorafterpartialhepatectomyanditsimplicationsforinitiationofliverregeneration.Hepatology,1995.21(6):p.1695-701.Jimenez-Sanchez,M.,etal.,TheHedgehogsignallingpathwayregulatesautophagy.NatCommun,2012.3:p.1200.Carpenter,R.L.andH.W.Lo,HedgehogpathwayandGLI1isoformsinhumancancer.DiscovMed,2012.13(69):p.105-13.Eichenmuller,M.,etal.,BlockingthehedgehogpathwayinhibitshepatoblastomaHepatology,2009.49(2):p.482-Duncan,A.W.,C.Dorrell,andM.Grompe,StemCellsandLiver14Gastroenterology,2009.137(2):p.466-Mishra,L.,etal.,Liverstemcellsandhepatocellularcarcinoma.Hepatology,2009.49(1):p.Yang,L.,etal.,Sonichedgehogisanautocrineviabilityfactorformyofibroblastichepaticstellatecells.JHepatol,2008.48(1):p.98-106.Jung,Y.,etal.,Accumulationofhedgehog-responsiveprogenitorsparallelsalcoholicliverdiseaseseverityinmiceandhumans.Gastroenterology,2009.137(2):p.466-Mishra,L.,etal.,Liverstemcellsandhepatocellularcarcinoma.Hepatology,2009.49(1):p.Yang,L.,etal.,Sonichedgehogisanautocrineviabilityfactorformyofibroblastichepaticstellatecells.JHepatol,2008.48(1):p.98-106.Jung,Y.,etal.,Accumulationofhedgehog-responsiveprogenitorsparallelsalcoholicliverdiseaseseverityinmiceandhumans.Gastroenterology,2008.134(5):p.1532-43.Michelotti,G.A.,etal.,Smoothenedisamasterregulatorofadultliverrepair.JClinInvest,2013.123(6):p.2380-94.Tsukamoto,H.,etal.,Morphogensandhepaticstellatecellfateregulationinchronicliverdisease.JGastroenterolHepatol,2012.27Suppl2:p.94-8.myofibroblastictransformationofrathepaticcellsincultureandcirrhosis.AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol,2009.297(6):p.G1093-106.Nejak-Bowen,K.N.,etal.,Gliotoxin-inducedchangesinratliverregenerationafterpartialhepatectomy.LiverInt,2013.33(7):p.1044-55.Suarez-Cuenca,J.A.,etal.,Partialhepatectomy-inducedregenerationacceleratesreversionofliverfibrosisinvolvingparticipationofhepaticstellatecells.ExpBiolMed(Maywood),2008.233(7):p.827-39.Chan,I.S.,etal.,Alcoholactivatesthehedgehogpathwayandinducesrelatedprocarcinogenicprocessesinthealcohol-preferringratmodelofhepatocarcinogenesis.AlcoholClinExpRes,2014.38(3):p.787-800.Sawitza,I.,etal.,Thenicheofstellatecellswithinratliver.Hepatology,2009.50(5):p.Kordes,C.,I.Sawitza,andD.Haussinger,Hepaticandpancreaticstellatecellsinfocus.BiolChem,2009.390(10):p.1003-12.Kordes,C.,etal.,Hepaticstellatecellscontributetoprogenitorcellsandliverregeneration.JClinInvest,2014.124(12):p.5503-15.Mogler,C.,etal.,Hepaticstellatecell-expressedendosialinbalancesfibrogenesisandhepatocyteproliferationduringliverdamage.EMBOMolMed,2015.7(3):p.332-8.2．项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题（此分为重点阐述内容（1）Fah-/-小鼠肝再植过程中信号激活的表现虽然Hh信号通路的激活在部分肝切诱导的肝再生动物模型得现，Fah-／－小鼠做为肝损伤的模型早已用于肝再生的研究，但对在再生过程中Hh信号的激活和作用方式至今没有研究。主要原因在版本15前期的肝再生的研究集中于对肝切除模型中的实验观察。如果充分识Hh信号激前期的肝再生的研究集中于对肝切除模型中的实验观察。如果充分识Hh信号激活与各种肝再生的关系，尤其是更加接近于临床相关的再生，有必要广泛观察在各个现有的肝再生模型中是否普遍存在，进一步去追踪在不同的肝再生模型中是否有特殊性。在我们的长期作积累中，我们已经较全面地掌握了Fah-小鼠肝再生的基本规律其在近期的研究结果中，我们发现Hh信号通路成部分在Fah-的肝再生过程中有基因表达水平的改变，并且这发现的组成部分在基因水平改变与部分肝切除后的肝再生过程中的同在对这些成员的分我们将利用我们实验室专长的实验手段行观察分析。首先所得到的结果，是一个较长程中的时间点的结果，因此，我们的第一步工作将分析每一种发现因的Fah－／－小鼠肝再植过程中的时相变化，以期获得每关基因的变化过程，这个研究工作将应用Q-PCR来实的工作，将是对某些参与激活的成员在蛋白水平上的时相变化进行量分析，这个分析研究的目的在于，转录水平的改变与最终在蛋白平的结果有不一致的存在可能。在获得了对所发现的每一种基因的细变化过程的认识后，下一步的工作就是综合分析所有变化的基因相互关系，这是因信号通路中包含多个成员参与，对于Hh信号通路活动的作用，有可能存在Hh信号通路活动内部的相互用。我们在肝癌研究中的最新发现也证实这种存在进miR-1249的转录来下调PTCH1成正反馈循环促进肝癌版本16YB,ChenJetal,待发表。Fah－／－小鼠肝再植过程中，多个信号通路成员在YB,ChenJetal,待发表。Fah－／－小鼠肝再植过程中，多个信号通路成员在基因表达水平上的改变，已经反映有可能存在这种细的内部成员相互制约的调控机在分析了具体基因水平在时间过程中的变化规律，我们将实具体基因在空间上的相互关系。通过免疫组化和免疫荧光的方法，用针对某一具体成员的抗体，我们将有把已知有作用的成员，包括活作用和抑制作用，定位到具体的肝内特定细胞比如肝星状细胞，管细胞窦内皮细将有利于认识Hh信号通路成员对目标的具体作用方式。例如，在我们前期的研究中，我们已发现移植细的再植簇群（repopulatingnodule）与炎症细胞簇在取自再植过程S4，Hh互作用将得以另外，我们将信号通路的过程中，根据最新的研究启示，进一步应用我们前期建立Fah－／－小鼠肝再植过程于筛的样品库，进一步寻找新的相关基因，包括Hh通路中未被发现的新成员，和影响信号通路的其他通路的成（2Hh通路对肝再生中肝内非实质细胞和实质细Fah-/-小鼠肝再植过程中已经发现了信号通路的为了进一步了信号通路的激活是否影响及如何影响肝再生的程，包括对实质细胞和非实质细胞的既往的小鼠肝切除模型给予Hh通路的抑制剂后发现通路下游Gli表达降低，肝再生能力减弱。首先我们将在Fah-/-小鼠肝版本17型中比较给予Hh信号通路抑制Smo，Hhip，Gli基因的表达否与肝切除模型中比较给予Hh信号通路抑制Smo，Hhip，Gli基因的表达否与肝切除模型的有无然后分析给药28Hh成员基因的变及在不同的时间过程中定量地分析肝再植的程度再综合分析这些基因的变化与肝再植程度的关系。目前已有特异性对Hh信号通路HhSmo、Gli不同基因的抑制剂，我们将分应用后研信号通路在经典的激活途径之外是否存在内部其他相互作用。另外，通过免疫组化和免疫荧光的方法，研究Hh的抑制对肝实质细胞和/或肝非实质细胞的分析有无存在肝非质细胞如星状细胞、肝窦内皮细胞自分泌或旁分泌信号因子途（3）提高Hh信号途径中关键因子的表达肝再生中肝内细胞和实质细胞的提高Hh信号通路中关键因子如Smo的表达，上调Hh信号通路活性，研究其对肝再生的影响。首先我们将利SleepingBeaty统携带shRNA等手段，验证Hh信号通路活性能否上调，实现对基转入方法提高Hh通路的可行性认识。在这个基础上研Hh的成员对移植细胞肝再生的调控关系。这样我们就了解了在亚急性损伤的情况下Hh信号通路的活性对移植细胞肝再生的作用。果这是可行的们将进一步探讨在健康肝的情况Hh路的活性对肝再生有无影响及其安全性的研究。这将有助于将来利调控信号通路成员来实现在临床的初步应用2）研究版本18（1）总体目研究在肝再生过程中信号通路的激活是否遍存在。而对于不同类型肝（1）总体目研究在肝再生过程中信号通路的激活是否遍存在。而对于不同类型肝损伤引起的不同肝再生过程是否存在特的调控方各类肝损伤引起的再生中Hh通路是被激活的此通路是否对临床治疗有指导意义和临床应用（2）具①各种类型的肝再生过程中的激活是否广泛存在，并是否针对特定肝再生的情况，具有不同的活动②确定肝再生中 配体的诱导释放和某些通路成员基因的表是如何被诱导激活的③确定肝再生中，Hh以及Hh通路下游的靶细胞的类型，将来潜在在肝损伤修复的作用获得理论依据和潜在Hh④确定通路激活产生的作用是否为肝再生过程中无可替⑤检验通路的特异激活能促进肝究论文1篇，5分以上的研究论文2拟解决的关键科学问（1）肝再生是否有普遍激活，针对特殊的肝导的肝再生有无存在显著的特异（2）是什么原因引起配体的释放，是由什么细胞（3）再生中Hh配体作用的靶细胞，其具体方式如何（4）Hh激活是否为肝再生必要（5）对激活的专一调控能否促进肝再生中的肝实质细胞版本19实质细胞3．拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路验手段、关键技术等说明 研究实质细胞3．拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路验手段、关键技术等说明 研究Hh信号激活的表现形式。首先，在先前结果的基础上，我们将全面分析Hh信号激Fah-/-小鼠中移植肝实质细胞的再植过程中的表现形式。对移植肝质细胞的再植过程中的Hh信号激活表现形式的全面分析，有助于获具体Hh信号通路成员活动特点，和它们在整个过程中的具体变化，下一步的研究提供线索实现最终能够调控Hh信号激活的位点和程度在肝实质细胞移植入Fah-/-小鼠的肝脏后，每隔1周取再植小鼠肝脏组织，共8周，采用qRT-PCR和blot/免疫组化分别从水平和蛋白水平比较Hh信号通路在不同的时相的表达和激活情况将用到的PCR引物如下primerSequence(5'-TmProductsize2018s通过免疫荧光染色分析上述基因在肝再生进程中不同时间把上述基18s通过免疫荧光染色分析上述基因在肝再生进程中不同时间把上述基因表达定位于肝实质细胞和/或非实质细胞而表达的非实细胞又具体定位于肝星状细胞、窦内皮细在上述实验的基础上通过所获取的最新信息进一步筛选未知Hh信号通路其他成员和与Hh信号通路相联系的其他信号途径的可能与。提取上述各阶段肝脏组织的RNA，通分析基因谱。在基因表达的时项分析中，以传统肝切模型中各相关阶段的基表达谱作为研究的对照处理。根据基因表达谱筛选肝再生关键阶段信号通路其他成员如类运动蛋白(Cos2酸/苏氨酸蛋白激酶(FuFu抑制剂(SuFu)、蛋白激酶A(PKA)的可 Hh抑制剂对Fah-/-小鼠肝再植效率的影实验中应用Hh抑制剂的目的在于证明已发现Hh信号通路的激Fah-/-小鼠肝再植效率的影响，以及影响的程度。由于Fah再植的程度在研究中能够定量分析，因此，此项指标能体现Hh路激活对促进肝实质细胞增殖的程度。同时，预期结果也将能够说是否Hh信号通路激活的作用一旦被阻断，是否能被其他未知的促进生机理所在研究实验的实施中在再植的第2周开始应用Hh配体的抑制剂(GDC-版本21至第8Hh信号通路中各成员在mRNA水平和蛋白水平的抑制情至第8Hh信号通路中各成员在mRNA水平和蛋白水平的抑制情定量分析这个过程中移植细胞再植簇群是增长是否受到抑与Hh信号通路中成员受抑制的时序关系c.用相同的方法分析应用Smoothened(Smo)的口服拮CyclopamineGli1及Gli2诱导转录的抑制剂GANT61的情况下Hh信号路中各成员和移植细胞再植簇群的改变 提高Hh信号通路中关键因子的表达对肝再植的影此部分的研究将成为探讨将来实现调控Hh信号通路的活性所尝试。我们认真分析和不同Hh信号通路的成员后，选定了一下过基因转入的方式，实现这些成员基因的高表达。通过此部分的研实验，将实现对基因转入方法提高Hh信号通路活性的可行性的认识对具体的Hh信号通路成员基因转入实现初步的认识。此结果探讨将来利用Hh信号通路成员基因转入实现初步在临床应用的可a.采用SleepingBeaty转座系统，将Smo基因的shRNA导入Fah鼠肝利用定量PCR和免疫荧光染色研究Hh信号通路中各成员的达是否增强，再分析比较其是否能促进移植细胞再植簇群的给导入Smo基因的shRNA的Fah-/-小鼠从第2周开始给予NTBC以停肝损伤，通过定量PCR、免疫荧光染色、免疫组化染色分析Hh信号的激活对健康肝的肝再植的2）关键本项目所涉及的研究方法主版本22（1）Fah-/-小鼠的肝实质细胞移Fah-/-小鼠的肝实质细胞术是申请人长期使用的实验技术。主（1）Fah-/-小鼠的肝实质细胞移Fah-/-小鼠的肝实质细胞术是申请人长期使用的实验技术。主要操作是将分离好的肝实质细分散在PBS液中，通过脾脏注射将肝实质细同时撤除水喂外源肝实质细胞将在Fah-/-小鼠肝脏中再生重建整个（2）SleepingBeauty转座子系统。SleepingBeauty转座子系转座酶可将两个转座子间的序列转移到哺乳动物细胞基因组当中。们设计的Beauty转座子系统的两个转座子间，包括Fah基和shRNA的表达序列（图1。当将该Beauty转座子质粒通尾静脉快速注射到Fah-/-小鼠体内后，部分质粒可进入肝实质细胞表达转座酶，并将转座子间的序列插到基因组当中。当给Fah撤除NTBC水后，插入该序列的肝实质细胞可表达Fah基因而存表达Fah的肝实质细胞将会死亡。表达Fah基因的肝实质细胞从而大增殖重建小鼠3）可行性分在本项目中，影响其可行性的主要因（1）Fah-/-小鼠肝再生实验室已大量繁育出该小鼠用实验。申请人过去多年的研究中一直使用该小鼠模型，十分熟悉相的如肝实质细胞移植、尾静脉注射等版本23（2）SleepingBeauty统。该转座系统早已应Fah-/-小的肝再生研究当中，且已发表多篇论文。（2）SleepingBeauty统。该转座系统早已应Fah-/-小的肝再生研究当中，且已发表多篇论文。申请人实验室已获得该转系统，并已开始应用除上述实验系统外，其余的实验均为常规的生化、分子、遗验。申请人实验室均已建立相关的实验平台。申请人认为本项目已备了顺利开展和圆满完成的4．首次系统性验信号通路激活在亚急性肝损伤肝过程中的5．年度研究计划及预期研究结果（包括拟组织的重活动、国际合作与交流计划等1）年度2016.1-确定Fah-/-小鼠中移植肝实质细胞的再植肝再生过程中的分析信号激活的表现2017.1-抑制和激活Hh号通路对肝再生中肝内非实质胞和实质细胞的影响2018.1-2018.12:确定信号通路调控肝实质细胞增殖2019.1-2019.12:在其他肝损伤模型中验证上述机制理数文章并投稿2）预期（1确定Fah-/-小鼠肝再生过程中Hh信号激活的表现形式和时空（2）确定Hh信号激活对促进肝实质细胞增（二）版本241．工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究成绩我1．工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究成绩我们通过分析肝实质细胞移植Fah扩增过程，确认该肝再生模型中，外源肝实质细胞的大规模扩增主发生在细胞移植后2-5周（图S1AKi67染色说明该有外源肝实质细胞（Fah性细胞）发生增殖（图S1B。由于实质细胞易于实验操作，Fah-/-小鼠肝损伤模型十分适于研究肝实细胞在肝再生过程中的图 Fah-/-小鼠肝再生过程2）我们的前期研究工Fah-/-小鼠移植细第1周至第8周的存活情况以看到在第5开始出现明显的增殖并且在第6周达到平台期，在第8周的时候趋于稳定（图S2版本25Fah-/-小鼠移植细胞后再植簇群的Fah-/-小鼠移植细胞后再植簇群的增殖情3）我们microarray了肝实质细胞Fah2周70%肝切12小时（即肝切模型中肝实质细胞起始增殖的时间）肝脏基因表达谱。我们发现，与肝切模型相比，肝Fah肝实质细胞起始增殖时，Hh信号通路中的Ptch著上调12（S3A而作为抑制因子的Hhip显著下调5倍（S3B未显示没有明显变化的版本26图S3Fah-/-小鼠和肝切除模型肝再生图S3Fah-/-小鼠和肝切除模型肝再生过程的基因表达4我们已发现Fah-/-小鼠移植细胞的再植（repopulating与炎症细胞簇在取自再植过程的肝组织免疫组化切片染色分析中信号通路作用下的细胞与细胞相互作用（图S4图S4细胞-细胞相互作用，Hh配体的释放可能包括来自与再殖区相接触的炎细胞5小鼠的基因治疗（S5A。将含有Fah光素cDNASBFah-/-小鼠的肝细胞，获得了Fah基因（S5，B）和荧光素基（S5，C）的稳定表达。通过非侵入性活体体内光学成像技术，版本27时定量观察了表达蛋白的肝细胞在Fah-/-小鼠肝脏中的再殖情因此，我们时定量观察了表达蛋白的肝细胞在Fah-/-小鼠肝脏中的再殖情因此，我们已经具备了系统传递外源基和利用非侵入性体外荧光成像技术评价肝脏再殖的图S5课题合作者实验室曾进行Fah-/-小鼠肝脏中非病毒性转基因载体的检测6）课题合作者实验室比较了诱导酪氨酸血症和不诱导酪氨酸血症但分肝切Fah-/-小鼠间肝细胞移植后的肝脏再殖情况。移植型肝细胞，停药后Fah-/-小鼠的肝脏再殖可达到95%以上（图6，细胞移植后的时间效应。在肝脏再殖过程因为血症，其内在的肝细胞逐渐死亡，供体肝细胞明显增3000倍。另一方面，给与NTBC药物的Fah-/-小鼠是健康的大部肝切除，小鼠肝脏再殖效率却不超过1%氨酸血症，内源性肝细胞与供体肝细胞相比更具生长版本28图 诱导酪氨酸血症和不诱导酪氨酸血症但部分肝图 诱导酪氨酸血症和不诱导酪氨酸血症但部分肝切Fah-/-小鼠间肝细胞移后肝脏再植的比2．工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条； 也是动物学国家重点学科、国家“实版本2942503．承担科研项目情况（申请人和项目组主要参与者正在承担项目包括国家42503．承担科研项目情况（申请人和项目组主要参与者正在承担项目包括国家自然科学基金的项项目的名称和编号经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等王欣正在承担的基金1、转录因子GATA4和Foxa2在调控内胚层细胞肝向分化中的相互作用。（31271469，902利用新型基因敲除和细胞转移技术建立人源化肝脏猪的模型（31271042，804．完成国家自然科学基金项目情况（对申请人负责的前一个科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘（限字）和相关成果的详细目录无（三）购置单项经费万元以上固定资产及设备等，须逐项说明与项的直接相关性及必（四）无版本30教育经历（按时间倒排序---教育经历（按时间倒排序---工作经历（科研与学术工作经历，按时间倒序排序授；1992/7—1995/9：B2012101；2012.9-2014.9版本31版本32王简历王欣，男，1963年7月18日生，理学博士，教授，博士生导师现在任东莞明珠实验动物有限公司客座教授，内王简历王欣，男，1963年7月18日生，理学博士，教授，博士生导师现在任东莞明珠实验动物有限公司客座教授，内蒙古大学教授，美国两公司的创办人。主要从事肝细胞生物学、肝脏和胰腺干细胞以及全能性干的肝向分化、人源化肝脏嵌合体动物等研究，近年来取得了一系列突出的成绩。项目的共同设计教育经历（从大学本科开始，按时间倒排序年——2003年，美国Oregon大学，医学院年——1998年，美国纽约州立大学，攻读博士年——1990北京医科大学，生物与遗传系，攻读年——1985年，山东大学，生物系，攻读本科学工作经历（科研与学术工作经历，按时间倒排序2011年至今，东莞松山湖明珠实验动物公司，客座教2006年——2011年中国科学院上海生化细胞所，中国科学院干细胞生学重点实验室主年——2008年，明尼苏达大学，实验医学和病理学系，干细胞研所任助理教年——1998年，美国纽约州立大学，药物与药理学院，生物化学的理学系，研究生研究1990年——1992年，北京医科大学，生物与遗传系1987年——1990年，北京医科大学，生物与遗传系版本331、发现了造血干细胞能转化为有代谢功能的肝脏实质细胞（AmericanJournalof（Nature20031、发现了造血干细胞能转化为有代谢功能的肝脏实质细胞（American