胚胎植入前遗传学诊断

胚胎植入前遗传学诊断主要内容PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展主要内容PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展生殖与遗传的影响会贯穿人的一生NeonatalScreeningGeneticTestingPrenatalDiagnosis产前诊断Preimplantation

GeneticDiagnosis/

Screening新生儿筛查遗传检测与诊断临床体格检查个人用药史家庭用药史实验室检测植入前遗传学诊断染色体检测（植入前遗传学筛查）分子检测，例如突变的检测胎儿影像学检测绒毛活检、羊水穿刺、采集脐血等。常见遗传疾病，例如苯丙酮尿症。ImagefromMcGraw-HillCompanies,

Inc.试管婴儿与胚胎植入前遗传学诊断收集生殖细胞

体外受精

受精卵分裂植入第一代卵细胞精子第二代（ICSI)健康胚胎第三代(PGD)ICSI检测受体妈妈的卵细胞供体妈妈的卵细胞体外受精线粒体基因检测受体的受精卵供体的受精卵（精子为同一来源）第四代PGD胚胎植入前遗传学诊断-定义胚胎植入前遗传学诊断（Preimplantation

Genetic

Diagnosis,

PGD）是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法。这种方法可有效地防止遗传性疾病患儿的出生，是产前诊断的延伸，是遗传学诊断的又一更有希望的新技术。PGD 绒毛采集 羊水采集 脐血采集胚胎植入前遗传学诊断-背景大多数的遗传性疾病目前还缺乏有效的治疗手段。对患病胎儿进行选择性流产/引产给孕妇造成身心的双重伤害；不可避免遗传性疾病的垂直传递。主要内容PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展胚胎植入前遗传学诊断-发展历史1967年1978年1983年Robert

Edwards与Richard

Gardner完成兔子囊胚活检后的性别鉴定世界第一个试管婴儿在英国诞生（RobertEdwards）Kary

Mullis提出聚合酶链式反应（PCR）1993年2010年Kary

Mullis获得诺贝尔化学奖Robert

Edwards获诺贝尔生理医学奖胚胎植入前遗传学诊断-发展历史1989年

英国的AlenHandyside首次报道胚胎活检及DNA扩增对胚胎行性别鉴定的技术；1990年英国的Alen

Handyside等完成的世界第一个PGD婴儿诞生（X-连锁隐性遗传病）；1992年

比利时Andre

Van-Steirteghem团队首次报道卵母细胞浆内单精注射（ICSI）成功妊♘的技术；1992年

Handyside等再次完成CFTR的PGD婴儿（常染色体隐性遗传病）诞生，自此PGD得到蓬勃发展。2000年

我国中山大学第一附属医院庄广伦教授等完成的国内第一例PGD婴儿诞生（FISH方法完成的血友病PGD）主要内容PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展胚胎植入前遗传学诊断/筛查-适应征非整倍体筛查：如21三体、18三体、13三体等染色体疾病：如平衡易位、罗氏易位等单基因病：如耳聋、苯丙酮尿症、DMD、SMA等易感基因的剔除：如BRCA1/BRCA2相关的乳腺癌等HLA分型：ESHRE数据显示51589个PGD周期所对应的适应征IndicationCyclesPercentageSinglegene

disorders11,08421%Aneuploidy

screening30,03358%Inheritedchromosomeabnormalities810416%SexingforX-linked

disease16033%Non-medical(social)

sexing7652%JClinMed.2014;3(1):

280–309.全球137个IVF中心所做PGD对应的适应征Indicationfor

PGDAneuploidytestingSinglegene

disordersStructuralchromosomerearrangementsFetalsexforX-linkeddiseaseNon-medicalsex

selectionAvoidadultonset

disorderHLAtypingwithdiseasetestingHLAtypingwithoutdisease

testingSelectionfora

disability*HLA=humanleukocyte

antigen.PercentofClinicsOffering

ThisTypeofPGD93%82%67%58%42%28%24%6%3%ClinMed.2014;

3(1):

28 0

.胚胎植入前遗传学筛查（PGS)用于非整倍体筛查胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation

Genetic

screening,

PGS）是一种所谓的“低风险”PGD,

最初是为了提高临床妊♘率和着床率而进行的一种筛查，其适应征为：高育龄妇女；反复胚胎种植失败的夫妇；复发性流产的

夫妇；不良孕产史等G.Hartonetal.,ESHREPGDconsortiumbestpracticeguidelinesfororganizationofaPGDcentreforPGD/PGS.HumanReproduction,2011;26(1):

4–24.①35岁以上妇女；②≥3次的优质胚胎移植着床失败的；③多次胚胎移植总移植胚胎数≥10着床失败的；④≥3次反复自然流产的。单基因遗传病PGD适应征：有遗传病家族史且已明确致病基因位点的常染色体显性、常染色体隐性、性连锁遗传的单基因遗传病夫妇；HLA分型；线粒体相关疾病，若线粒体DNA突变负荷与疾病严重程度成正相关，可以考虑PGD；携带有癌症等疾病易感基因的人群OMIM对遗传病及致病基因的统计数据NumberofEntriesinOMIM(UpdatedSeptember26th,

2015)XYPrefixAutosomalLinkedLinkedMitochondrialTotalsGene

description14,250701483515,034Geneand

phenotype,combined8220286Phenotype

description,molecularbasis

known4,2242984294,555Phenotypedescription

orlocus,molecularbasis

unknown1,509129501,643Other,mainlyphenotypeswithsuspectedmendelianbasis1,706112201,820Totals21,7711,242596623,138主要内容PGD的定义与背景PGD的发展历史PGD/PGS的适应症PGD的流程及相关技术PGD与伦理PGD的最新发展胚胎植入前遗传学诊断（PGD)1

遗传咨询2获得家系中所有相关人员的遗传信息10

健康宝宝出生3

基因检测与连锁分析9

产前诊断Start8

胚胎移植与着床4辅助生殖技术治疗75

体外受精及胚胎培养单细胞的致病靶基因检测连锁分析196卵裂球单细胞活检PGD/PGS临床流程Array

CGHSanger

SequencingFISHNextGeneration

SequencingTur-Kaspa,I.etal.(2014)PreimplantationgeneticdiagnosisforinheritedneurologicaldisordersNat.Rev.Neurol.

doi:10.1038/nrneurol.2014.84PGD各步骤的时间控制JiangB,etal.,BestPractResClinObstetGynaecol.

2012;26(5):551-9.单基因遗传病PGD难点:1.样本难以获取2.痕量样本3.易污染4.等位基因脱扣5.同源重组以上难点是造成单基因病胚胎植入前遗传学诊断发展的主要障碍。胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的关键技术如何安全地获得有效胚胎遗传性样本—显微操作取样如何准确地完成遗传性样本的筛查/诊断—单个/3-5个细胞的检测PGD过程中所涉及的显微操作目前多采用激光打孔、机械切割或Tyrode酸化打孔后吸出细胞的方法取材。第1极体移除（1stpolarbody

removal）2 体移除（2ndpolarbody

removal）母细胞胞浆内单精子注射（IntraCytoplasmicSpermInjection,

ICSI）3天卵裂球活检（day-3embryo

biopsy）5-7天囊胚外胚层细胞活检（day-5–7blastocyst/trophectoderm

biopsy）第1、第2极体移除（1st&2ndpolarbody

removal）减数第一次分裂正常可能形成的极体组合GeneticsandMolecularBiology,37,1(Suppl),271-284,

(2014)减数第一次分裂异常可能形成的极体组合（1）GeneticsandMolecularBiology,37,1(Suppl),271-284,

(2014)减数第一次分裂异常可能形成的极体组合（2）GeneticsandMolecularBiology,37,1(Suppl),271-284,

(2014)交叉重组可能形成的极体组合针对单基因病检测GeneticsandMolecularBiology,37,1(Suppl),271-284,

(2014)PGD过程中所涉及的显微操作优点缺点备注不影响卵子受精和正常发育；不会引起伦理争议；对胚胎创伤小 可间接反映母不能检测父源性遗传缺陷；不能检测受精期间或受精前、后极体源遗传缺陷受精后异常；3. 极体容易发生退化，影响诊断效率。卵裂球胚胎数量相对多；诊断准确性较高1.

检测细胞数量相对少，一般取单细胞3天后6-10细胞期胚胎完成一次自我选择，临床妊娠率提高；可以获得更多的检测细胞数1. 囊胚形成率仅为50%左右，可检胚胎数量有限；5-7天囊胚期取滋养层细胞囊胚量3. 诊断准确性高2. 可供诊断时间短，可能需要冷冻胚胎冻胚与新鲜胚胎移植的出生结局比较

Frozen-thawed

ET=

211Fresh

ET=915P

valueBirthweight(g±

SD)3354.9±

626.33200.1±

632.7*0.001Meangestation

age(weeks±

SD)38.6±

2.5938.5±

2.510.558Pretermbirth**

(%)9.012.10.232Foetaldistress

(%)3.33.71.000Caesareansection

(%)25.125.80.930Admittanceto

neonatalintensivecareunit

(%)5.77.40.458Low(0–6)5-minute

Apgar1.41.61.000score

(%)Congenital

malformation(%)6.27.40.657Chromosomalmalformation

(%)00.11.000*Statisticallysignificant(P<0.05),asrevealedbyt-test.**Pretermbirth—birthbefore37weeksof

gestation.SaraKorosec,etal.,BiomedResInt.2014;2014:

431797.PGD/PGS的检测相关技术Sanger

SequencingFISHArray

CGHMultiplex

PCRNextGeneration

SequencingMLPA荧光原位杂交-（

fluorescent

in

situhybridization，FISH

)FISH问世于20世纪70年代，是在同位素原位杂交基础上发展起来的。原理是如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列，最终完成定性、定位、相对定量分析。Speicher,M.R.etal.NatureReviewsGenetics6,784

(2005).FISH应用于染色体异常的PGD不同人群中染色体异常发生率普通人群中染色体异常的发生率

0.5-0.85%，RSA人群中染色体异常发生率

3.67%-9.66%，不孕不育人群中染色体异常发生率

1.96%-13.1%。(ElvaCortes-Gutierrez,2009;

E.Clementini,2005)PGD/FISH病例：罗氏易位携带者行PGD罗氏易位即罗伯逊易位，或丝端融合。发生于近端着丝粒染色体之间-13，14，15和21，22号染色体。最重要的罗氏易位发生在14和21号染色体之间。当两个近端着丝粒染色体在着丝粒部位或在着丝粒附近部位发生断裂后，二者的长臂在着丝粒处接合在一起，形成一条由长臂构成的衍生染色体，两个断臂则构成一个小染色体，小染色体往往在第二次分裂时丢失。病例1

PGD/FISH-罗氏易位病史：女，30岁。人工流产1次；自然流产2次均为妊♘80+天胚胎停止发育。染色体核型：女方:

45,XX,14,

21,+t(14q21q)；男方:

46,XY。再发风险：女方为罗伯逊易位携带者，是2次胚胎停育的原因。再次生育有1/6生育染色体完全正常的可能，1/6生育携带者可能，2/3发生流产、死胎、畸形可能。建议：应用FISH技术（14/21染色体探针）进行PGDPGD/FISH-罗氏易位ABCDFISHforRobertsontranslocationcarriera.

14,14/21,21 b.

14,14/21,21c.14,14/21,21,21d.21,21e.

14/21,21 f.

14,14/21 E

F ICSI-PGD后，患者获得临床妊♘，并产前诊断进一步确诊，最终生育了一个健康的孩子。微阵列比较基因组学杂交技术-（array-basedcomparativegenomichybridization,

aCGH)PGD/aCGH病例1:相互易位携带者行PGD两条染色体分别发生一次断裂，相互交换片段后重组，称为相互易位，其结果是形成两条衍生染色体。PGD/aCGH病例1:相互易位携带者行PGD病史：女，27岁。继发性不孕2年。妊♘5个月胎死宫内行引产术后。核型：

46,

XX,

t

(10;

12)

(q11.2;

q15)；男方核型：

46,

XY。风险评估：告知女方染色体为相互易位。女方为携带者，表型可以完全正常。再次妊♘有1/18生育染色体完全正常胎儿的可能，1/18生育相互易位携带者可能，其余有流产、死胎、畸形的可能。(例图)建议：1、首选进行胚胎植入前遗传学诊断，孕4个月行产前诊断。2、自然妊♘后行产前诊断。PGD/aCGH病例1:相互易位携带者行PGDPAIRINGAT

MEIOSISq21q23Eg.46,XX,t(3;21)

(q23;q21)PGD/aCGH病例1:相互易位携带者行PGDPAIRINGAT

MEIOSISADJACENT2——UNBALANCED——ADJACENT2——UNBALANCED——3:1——UNBALANCED——3:1——UNBALANCED——3:1——UNBALANCED——3:1——UNBALANCED——染色体分离后配子类型与正常配子可能形成的18种合子核型或

XY或XY,

+der(10),+der(12),t(10;12)(q11.2;q15),-10,-12或XY,+der(12)

t(10;12)(q11.2;q15),-12+der(10)

t(10;12)(q11.2;q15),-10或

XY,ABCDADCBAB

CBAD

CDABADCBCDABAB*CDCD*CBCB*AD

AD*ABCBCDADCBCDADABCDAD

ABCBADABCBCD46,

XX46,

XX46,

XX46,

XX46,

XX46,

XX46,

XX46,

XX46,

XX46,

XX47,

XX45,

XX47,

XX45,

XX47,

XX45,

XX47,

XX45,

XX或XY,+der(10)

t(10;12)(q11.2;q15),-12或XY,+der(12)

t(10;12)(q11.2;q15),-10或XY,+10,

-12或XY,-10,

+12或XY,+2der(12)

t(10;12)(q11.2;q15),-10,-12或XY,+2der(10)

t(10;12)(q11.2;q15),-10,-12或XY,+der(12)

t(10;12)(q11.2;q15)或XY,+der(10)

t(10;12)(q11.2;q15),-10,-12)或XY,+der(10),+der(12),

t(10;12)(q11.2;q15),-10或XY,-12或XY,+der(10)

t(10;12)(q11.2;q15)或XY,+der(12)

t(10;12)(q11.2;q15),-10,-12或XY,+der(10),+der(12)

t(10;12)(q11.2;q15),-12或XY,-10PGD/aCGH病例1:相互易位携带者行PGD#4:Balanced;

euploid#11:

+(10q11.2-pter),-(12q15-pter)+(10q11.2-pter)-(12q15-pter)PGD/aCGH病例1:相互易位携带者行PGD#胚胎序号结果注释4Balanced;

Euploid可移植6-10(q11.2-pter),

+12(q15-pter)异常9Balanced;

Euploid可移植11+10(q11.2-pter),

-12(q15-pter)异常共获卵11枚，受精后培养至卵裂期获胚胎8枚，培养至囊胚期获胚胎4枚进行PGD。PGD/aCGH病例2:复发性流产（RSA）患者行PGD病史：一对年轻夫妇，婚后4年。自然妊♘3次，均于妊♘50+天胚胎停育。夫妇双方染色体正常，其他检查无阳性发现。诊断：首先应查找病因。染色体异常其他：免疫因素、内分泌因素、解剖因素等。（见RSA筛查表）该对夫妇所有检查项目未见异常，为不明原因性复发性流产（uRSA）。建议：针对病因进行治疗；uRSA进行胚胎植入前遗传学筛查（PGS）。RSA筛查表检测项目检测项目女方染色体β2-GP1是否检测、检测日期、检测结果、是否治疗、复查结果、处理建议TORCHD-二聚体PPD狼疮抗体ANA血型抗体ACATVB+妇检DS-DNAHSG封闭抗体宫腔镜基础内分泌(FSH、LH、PRL、E2、P、T0、TSH)蛋白C甲状腺功能蛋白S阴道分泌物凝血四项MTHFR男方染色体精子畸形率血型RSA组项(MAR形态、核蛋白+DNA组项)精液常规PGD/aCGH病例2:复发性流产（RSA）患者行PGDE2:+17E3:Balanced;

euploidPGD/aCGH病例2:复发性流产（RSA）患者行PGDarray-CGH PGSfor

RSA胚胎序号结果解释2+17异常3Balanced;

Euploid可移植4+13异常8-8异常12Balanced;

Euploid可移植15Balanced;

Euploid可移植PGD/aCGH病例2:复发性流产（RSA）患者行PGD既往文献报道回顾性分析：对URSA夫妇行PGS，共计287个周期，2282枚胚胎。1.

D3非整倍体胚胎率高于D5（47.0%vs.

31.2%;P<.0001）。2.

PGS后，URSA患者自然流产率降低。Hodes-Wertz,B.,etal,

2012单基因病PGD检测基本流程AtlasofpreimplantationgeneticDiagnosis.ThirdEdition.Anver

Kuliev.Sanger测序及STR位点分析PGD:甲型血友病家系-X连锁隐性遗传甲型血友病是X连锁的隐性遗传病。因子VIII的缺乏是其致病原因。活产新生儿的发生率是1/5000。发病率是乙型血友病的4倍。病史生育过甲型血友病患儿曾经有过16周的胎儿诊断为甲型血友病并行引产夫妻来诊，要求进行血友病致病基因筛查PGD:甲型血友病家系-X连锁隐性遗传12K

bp10K

bpPQ PB AQ AB PQ PB AQ AB PQ PB AQ ABNormalCarrierAffectFatherMotherFetusIntron22inversiondetectionofFVIIIgeneanalysisbylongPCRforthe

pedigree再发分析评估建议PGD

-

STR

连锁分析;PGD

-

FISH

(选择女性胚胎);产前诊断PGD:甲型血友病家系-X连锁隐性遗传STRMotherFatherProbandE2E3E5E8E10E12E13E14E15E16E18E19E20STR

1242/244244242244242/244244242/244244/244242242244/244244/244244/244242/244244244STR

2358/376380376358376/380358376/380358/380376376358/380358/380358/380376/380358358STR

3253253253STR

4241229241STR

5382/386382382386382/382386382/382382/386382382382/386382/386382/386382/382386386STR

6181181181STR

7217/239?219?217?STR

8150152150STR

9208206208GenotypeCarrierNormalAffectedNormalCarrierNormalCarrierNormalETAffectedAffectedNormalNormalNormalCarrierNormalNormal12K

bp10K

bpPrenataldiagnosisbylongPCRwithDNAfromamniotic

fluidPQ PB AQ

AB

PQ

PB

AQ

AB不携带致病基因的健康女婴出生。Normal

ControlFetusselectedby

PGDPCR-PGD可真正阻断致病基因的垂直传递-

X连锁隐性遗传病FISH-PGD通过选择性别可避免男性患儿的出生，但不能避免女性携带者的出生；PCR-PGD通过连锁分析可选择正常胚胎植入，可避免携带者的出生，真正意义上阻断致病基因的垂直传递。PGD:肝豆状核变性家系-常隐遗传肝豆状核变性或肝退化是一种铜在组织内累积的常染色体隐性遗传疾病，显现神经异常并肝脏疾病。在肝豆状核变性疾病中，肝脏无法正确过滤铜离子，导致铜离子在肝，脑，眼及其他器官中的累积，久而久之，高浓度的铜导致威胁生命的器官损伤。家系病史I1

和

I2

夫妇育有一个女儿，16岁时被发现是肝豆状核变性疾病患者。该夫妇想生育一个健康的孩子，遂来我中心进行遗传咨询。I12II1PGD:肝豆状核变性家系-常隐遗传ATP7Bc.3029

A>CATP7Bc.2333

G>TATP7Bc.2333G>T&c.3029

A>C先证者同时发生ATP7B基因

c.2333G>T和c.3029

A>C两个突变，分别来自母亲和父亲。PGD:肝豆状核变性家系-常隐遗传ATP7B-1N227216229229ATP7B-2N201199209203ATP7B-3N263261257267ATP7BMNMNATP7B-4N176182228186164162195201230230195193ATP7B-5N162162ATP7B-6N201201ATP7B-7N230232ATP7B-8NATP7B-9N195193ATP7B-10M176228162164201195230230195195共选取了10个STR位点，SMN1基因上游3个，下游7个，最终8个有效的STR位点用于后续的PGD连锁分析。N—Normal

alleles

正常等位基因M

—Mutant

alleles

突变等位基因Green

—available

STRs

可用STR位点Blue—Target

gene

目的基因Red—STRslinkedwithmutant

alleles与突变等位基因连锁的STR

位点Black—STRslinkedwithnormal

alleles与正常等位基因连锁的STR位点PGD:肝豆状核变性家系-常隐遗传E1E3Normal

ATP7BEmbryoID216229199203STRs261N267Nlinkage182186analysis162162201201232230193193216229199203261267NN182186162162201201232230193193PGDNormal

ATP7BNormalTarget

genesequencingPredictedPhenotypeNormal胚胎移植顺次胚胎编号Outcome1E1成功妊娠并生下健康男婴PGD:成人多囊肾家系-常显遗传成人多囊肾（Autosomal

dominant

polycystickidney,

ADPKD）系常染色体显性遗传病，是最为常见遗传性疾病之一。发病率为1/400‐1/1000。与ADPKD相关的基因为位于16号染色体上PKD1(TRPP1)和PKD2(TRPP2)，大约85%的ADPKD是由于PKD1基因突变所致，大约15%是由于PKD2基因突变所致。PKD1基因突变主要表现为错义突变、无义突变、剪切、插入、缺失、重复等类型，目前已发现74种导致常染色体显性遗传的成人多囊肾的PKD1基因突变类型。常染色体隐性遗传多囊肾疾病(autosomalreces-sive

polycystic

kidney

disease,ARPKD),也称多囊肾肝病(polycystic

kidney

and

hepaticdisease,PKHD),是一种多发于儿童肾脏及肝脏的严重单基因遗传病,发病率为1:20000~1:40000。PGD:成人多囊肾家系-常显遗传PKD1基因c.7867

G>T，p.Glu2623Ter

杂合突变女方正常家系遗传病史：该夫妇未生育孩子，男方为患者，并且有家族成员患病。生育之前行PGD检测。女方原发性不孕，男方患常染色体显性成人多囊肾。常染色体显性遗传单基因病无先证者家系单精子连锁分析及PGD检测219

223156

158232

239156

164N? M?172

182233

237177

181N N172

178235

237177

188正常等位基因M

—致病等位基因绿色标记-

—有效STR位点蓝色标记—目的基因及其位置红色标记—致病基因连锁STR位点黑色标记—正常等位基因连锁STR位点PKD1-1NPKD1-2NPKD1-3NPKD1-4NPKD1-5NPKD1-6NPKD1PKD1-7NPKD1-8NPKD1-9NPKD1-10NPKD1-11NPKD1-12NPKD1-13NPKD1-14NPKD1-15N158

164156

156N N182

178177

188M N172

172181

177219223158156NM182172233237177181PKD1基因测序结果c.7867

G>T突变未见

c.7867

G>T突变胚胎4胚胎6未见

c.7867

G>T突变c.7867

G>T杂合突变高通量测序平台的临床应用PGD/PGS癌症检测全基因组/外显子测序基础科研NIPT单基因病筛查IlluminaNextseq

500Lifeiontorrent

PGMLifeiontorrent

Proton目前国内比较主流的平台高通量测序在辅助生殖领域的应用新生儿遗传病筛查精子卵子新生儿NIPT产前诊断胚胎/囊胚植入后妊娠胎儿PGD/PGS12周后流产组织学分析自然/选择性流产新一代测序新一代测序全基因组扩增（WGA）Sureplex-MALBAC-MDA方法比较三种不同WGA方法扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

三种不同WGA方法扩增产物进行拷贝数变异检测（CNV）对比图SurePlex

和MALBAC

方法在拷贝数变异（CNV）检测上优于MDA

方法。MALBAC方法对GC含量高的序列有扩增偏好，但通过生物信息学方法矫正后也可准确地分析拷贝数变异（CNV），对于GC含量较高的物种可以选择该种方法。MDA方法操作简单，但扩增比较随机，对GC含量没有偏好性，在SNP的研究中具有优势，特别是在样本量较少的情况下。ThePerformanceofWholeGenomeAmplificationMethodsandNext-GenerationSequencingforPre-ImplantationGeneticDiagnosisofChromosomalAbnormalities.NaLi,LiWang,etal.JGenetGenomics.2015Apr20;42(4):151-9.doi:10.1016/j.jgg.2015.03.001.Epub2015Mar14.Quantitativeassessmentofsingle-cellwholegenomeamplificationmethodsfordetectingcopynumbervariationusinghippocampalneurons.NingL,LiZ,etal.SciRep.2015Jun19;5:11415.doi:

10.1038/srep11415.三种检测平台aCGH-PGM-illumina Nextseq500 植入前非整倍体筛查（PGS）检测结果对比对比分析图例：19号样本4×Ion

torrentPGM2×1×0×46XY,高风险

-aCGH46,XYillumina46,XY,-7q(q31.2→qter)(嵌合疑似)对比分析图例：

20号样本Iontorrent

PGM4

，XX, 高风险

-8,-14aCGH46,XX,但软件报的可信度是1.00IlluminaNextSeq

50046,XX,-8,-14(嵌合疑似)对比分析图例：

26号样本1×0×46,XX,高风险（-7）Iontorrent

PGM4×2×46,XXaCGHIlluminaNextSeq

50046,XX(多条染色体嵌合疑似)小结不同的检测平台分析所得每条染色体的散点图趋势基本一致。不同的分析软件自动分析所得结果存在差别需要人工辅助区分。每个不同的平台及分析软件需要积累足够多的正常样本数据和数据分析经验，才能给出比较客观准确的检测结果。单基因疾病PGD面临的障碍和解决方法面临障碍解决办法非整倍体痕量样本没有更多的样本用于染色体非整体筛查全基因组扩增24条染色体的胚胎植入前筛查等位基因脱扣少等位基因脱扣率高SNP单体型分型痕量样本等位基因脱扣不可避免快速费时SNP分型不需要预实验STR差异个体化差异技术原理：单体型分型在单基因PGD中的应用基因型父亲母亲先证者CTCTCCACGAAGCGTATG父亲母亲单体型正常携带者携带者患者父亲母亲先证者CGTACCATCACGCAGTGT患者先证者高通量测序在PGD中的应用：病例：

脊肌萎缩症家系□

脊肌萎缩症是一种影响肌肉运动控制的遗传性疾病，由于运动神经元的损伤，导致控制爬、走、站立和头部运动的肌肉萎缩。I12□

脊肌萎缩症在人群中发病率约1/6000到1/10000，在汉族人群中的携带率约1/40到1/60。II12脊肌萎缩症由SMN1基因的异常或缺失引起，SMN1基因编码一种对运动神经元很重要的蛋白。大约95%的脊肌萎缩症病人均是由于SMN1基因外显子7的纯合缺失引起。家系病历I1和I2夫妇曾经有一个患脊肌萎缩症的女儿，3个月时夭折。I2在2013年再次怀孕，产前诊断发现又是脊肌萎缩症患儿，该夫妇进行了选择性流产。该夫妇很渴望生一个健康的孩子，前来我中心咨询。高通量测序在PGD中的应用：病例：

脊肌萎缩症家系MLPA结果显示先证者和胎儿均为SMN1基因外显子7和8纯合缺失。SMN1基因外显子7和8杂合缺失SMN1基因外显子7和8杂合缺失SMN1基因外显子7和8纯合缺失SMN1基因外显子7和8纯合缺失高通量测序在PGD中的应用：病例：

脊肌萎缩症家系传统STR的连锁分析用于脊肌萎缩症PGD

（对照）N M110 110SMN1-STR1SMN1-STR2186186186182SMN1-STR3176170166166SMN1-STR4SMN1-STR5142140146146N M110 116186

182221 225112 104223

215112 112170

166140

146SMN1SMN1-STR6SMN1-STR7SMN1-STR8SMN1-STR9SMN1-STR10SMN1-STR11SMN1-STR12188 180176

176M M110

116225

215104

112180

176N—正常等位基因M

—突变等位基因绿色—可用STR位点蓝色—目的基因红色—与突变等位基因连锁的STR

位点黑色—与正常等位基因连锁的STR位点高通量测序在PGD中的应用：病例：

脊肌萎缩症家系传统STR的连锁分析用于脊肌萎缩症PGD

（对照）E1E8E13E3E11E18E21胚胎编号182186186186186186186186186182186186186182166176176166176166170166170166166176170166STR连锁146142142146142146140146140146146142140146分析MNNNNNMNMMMNMM116110215221112112176188110110110110110110221223221223225223112112112112104112188176188176180176110116116110110116225215215221225215104112112112104112180176176188180176目的基因酶切预测的表型正常携带者携带者携带者患者患者SMN1

外显子7和8纯合缺失未见SMN1外显子7和8纯合缺失SMN1

外显子7和8纯合缺失未见SMN1外显子7和8纯合缺失未见SMN1外显子7和8纯合缺失未见SMN1外显子7和8纯合缺失未见SMN1外显子7和8纯合缺失正常胚胎移植高通量测序在PGD中的应用：病例：

脊肌萎缩症家系Ion

Torrent平台行胚胎植入前筛查（PGS）结果46,XY46,XX47,XX,

+2245,XY,

-4高通量测序在PGD中的应用：病例：

脊肌萎缩症家系先证者母亲 父亲

E1 E3E8E11E13E18E21SNP单体型分析胚胎GAGCTCGAGATCGCGCGCGAGCGAGCGCGATCGCG GC ATCTTCTTCTTTTTTTTTCTTTCAAGAAGAAAAAAAAAGAAAGCCTCCTCCCCCCCCCTCCCTTTCTTCTTTTTTTTTCTTT

CI12C C T C C T C C CC CC C T C C C T? ? ? ? ? ? ? ? ?? ?? ? ? ? ? ? ?TTCTTCTTTTTTTCTTT CII12PGDTTGTTGTTTTTTTGTTT GAAGAAGAAAAAG G T G G T G G G G G G G G G T G G G TA A G A A G A A A A A A AAAGAAA

GC C? ?T TT TA AAAGAAA GC C C C C C C C C C C C C C C C C C C C一个健康女孩在2015年1月降生。C,ATC,BTC,BCC,BTC,BTC,BTC,BTC,BCC,BTC,BCTA,CTB,CTA,TTA,CTA,CTA,CTA,CTA,TTA,CTA,TGTGTGGGTTTTTGTGGGTGGTCTCTTTCCCCCTCTTTCTTCTCTCCCTTTTTCTCCCTCCGAGAGGGAAAAAGAGGGAGGATATAAATTTTTATAAATAACTCTCCCTTTTTCTCCCTCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

A共7对夫妇26个胚胎样本利用SNP单体型分析进行了PGD,结果与传统的STR方法一致。正常胚胎移植携带者携带者正常携带者

患者患者问题:高通量测序及单体型分型可以帮助高龄夫妇通过PGD孕有无异常胎儿，但是孕妇大多不希望在孕后做有创的产前诊断来进一步确定孕育胎儿的情况。此时我们该怎么办？如何做？基于无创产前诊断的单体型分型单体型分型在生殖医学中的应用病例：先天性耳聋家系我国新生儿总的听力损伤率为9.52

‰

，其中50%遗传因素造成，约1500万。新生儿听力筛查，不能从根本上解决问题：一方面患儿不可能治愈，植入人工耳蜗不能痊愈，另一方面不能杜绝耳聋致病基因的垂直传递。PGD是目前唯一可预防耳聋发生的手段。Case

History一对表型正常的夫妇生育一个先天耳聋的患儿，目前患儿8岁（家系谱图见右上图）；欲生育一个健康孩子，遂行遗传咨询。遗传咨询：

在我国人群中的发病率相当高，约为1/1500。

高度遗传异质性

此外，一些环境因素也可引起先天性聋哑。

先天性聋哑中大部分是常染色体隐性遗传，存在着三十余种突变基因。此外，也存在常染色体显性遗传及X连锁遗传。单体型分型在生殖医学中的应用病例：先天性耳聋家系GJB2

c.299delATGJB2

c.235delCGJB2c.235delC&

c.299delAT一代测序结果显示先证者具有GJB2基因的c.235delC和c.299-300delAT

复合杂合突变，其中c.235delC来自母亲，

c.299-300delAT

来自父亲。单体型分型在生殖医学中的应用病例：先天性耳聋家系12个STR位点中筛选出7个有效的STR位点用于连锁分析236 236190 192188 188376 376121 121201 205236 236190 190188 188376 376121 121201 205153 155435 443247 251180 188107 105200 202155 155435 435247 247182 180109 107204 204236 236192 190188

188376 376121 121201 205GJB2-STR1GJB2-STR2GJB2-STR3GJB2-STR4GJB2-STR5GJB2-STR6GJB2GJB2-STR7GJB2-STR8GJB2-STR9GJB2-STR10GJB2-STR11GJB2-STR12155 155443 435在GJB2基因两侧选择了12个STR251247位点进行分析，最终挑选了7个STR位188180点用于后续PGD连锁分析。105107202204单体型分型在生殖医学中的应用病例：先天性耳聋家系8个胚胎用于胚胎植入前遗传学诊断胚胎编号STR位点E1 E2 E5E7E8 E9 E11E13192190190190192190192190192190192190192190192190155155153155155155155155155155155155155155155155443435435435443435443435443435443435435435443435251247247247251247251247251247251247247247251247188180180182188180188182188180180182180182188182105109107109105107105109105107107109107109105109202204200204202204202204202204200204200204202204一代测序结果患者GJB2c.

235delC/c.299delAT患者GJB2c.

235delC/c.299delAT患者GJB2c.

235delC/c.299delATGJB2c.299delAT携带者GJB2c.235delC携带者GJB2c.235delC携带者GJB2c.235delC携带者GJB2c.235delC携带者结论胚胎移植但植入失败第二次胚胎移植单体型分型在生殖医学中的应用病例：先天性耳聋家系二代测序和分析应用于胎儿非整倍体检测-无创产前检测母体外周血样本母体和胎儿游离DNA游离DNA进行大规模平行测序比对和计数SwansonA,etal.,CurrGenetMedRep,

2013;1:113-121单体型分型在生殖医学中的应用病例：先天性耳聋家系无创产前用于非整倍体异常检测胎儿的13、18及21号染色体均为三体低风险。测序平台:

Ion

Proton单体型分型在生殖医学中的应用病例：先天性耳聋家系单体型分型流程图DuanT.etal.,GeneticsinMedicine,2014;16(12):

972-976.单体型分析结果显示胎儿获得了父源正常等位基因和母源致病等位基因突变单体型(F1)父源正常单体型(F0)父源突变单体型(M1)母源正常单体型(M0)母源羊水DNA

样本GJB2基因一代测序结果GJB2

c.235del

C

(杂合)GJB2

c.299

(正常)胎儿具有GJB2基因c.235delC杂合突变和正常的父源等位基因，与PGD和产前诊断的检测结果均一致。新生儿脐血样本GJB2基因测序结果GJB2

c.235del

C

(杂合)GJB2

c.299

(正常)新生儿具有GJB2基因c.235delC杂合突变和正常的父源等位基因，与PGD和产前诊断的检测结果均一致。出生后听力筛查（1）自动听性脑干反应（AABR

）测试左耳右耳右耳瞬态诱发耳声发射（TEOAE）

测试左耳出生后2天进行AABR

and

TEOAE测试，结果正常。出生后听力筛查（2）VIII0 1I

2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516

171ms0.2

μV10111213141516

171ms0.2

μV0 1

I

2 3 4 5 6 7 8 9II