论文资料Caco-2细胞模型及其应用的研究进展

Caco-2细胞模型及其应用的研究进展王敏，齐云基金工程基金工程：国家自然科学基金资助工程〔No.30672659〕作者简介：王敏，女，硕士研究生*通讯作者〔中国协和医科大学-中国医学科学院药用植物研究所，北京100094〕摘要:目的介绍近几年来Caco-2细胞模型在药学方面应用的最新进展。方法依据近年来国内外相关文献资料，对有关Caco-2细胞模型自身及应用的开展进行了综述。结果与结论Caco-2细胞模型本身的改进与优化及该模型应用于改善口服药物吸收、药食相互作用等方面的研究取得了可喜的进展，而将Caco-2细胞模型应用于中药吸收特点研究的动向值得关注。关键词：Caco-2细胞模型；药物吸收；药食相互作用；中药Caco-2细胞(thehumancolonadenocarcinomacelllines)模型作为药物吸收研究的快速筛选工具，可在细胞水平上提供药物分子透过小肠黏膜的吸收、分布、代谢、转运以及毒性的综合信息。由于Caco-2细胞与体内药物，特别是那些被动吸收的药物具有良好相关性，已被广泛用于药物早期快速筛选过程中，并已成为研究药物吸收机制，预测体内吸收和药物相互作用等的重要工具。近年来研究者们对模型不断进行改进，在应用上也有诸多开展，本文将就近年这些研究动态进行综述。1对Caco-2细胞模型的优化研究尽管Caco-2细胞模型具有诸多优点，但仍然存在某些缺陷，如形成完全分化并具有紧密连接的单层细胞生物膜所需培养时间较长〔21～28天〕；缺乏分泌黏液的功能，不似小肠上皮能够形成黏液层；缺少或低表达某些药物代谢酶和转运体等。研究者们因此就这些缺陷对模型本身进行了一些改进。ChongS等[1]选用Biocoat肠上皮细胞分化环境〔BIEDE〕来培养Caco-2细胞，优化了细胞培养条件，仅用3天即培养出完全分化的单层细胞膜，缩短了细胞培养时间。该模型采用polyethylenet-erealate代替非聚碳酸酯作为细胞生长支持物〔滤膜材料〕；用纤维胶原Ⅰ型代替鼠尾胶原Ⅰ型作为促进细胞黏附的细胞外蛋白基质〔滤膜涂层〕；用丁酸代替含10％胎牛血清的DMEM作为培养基。小肠的吸收作用与粘液层的存在密切相关。小肠上皮粘液层的形成，取决于HT29细胞〔杯状细胞〕分泌粘液的能力，与其相比，Caco-2细胞为单一细胞，缺乏分泌粘液的能力，从而无法形成与小肠上皮相似的粘液层，此外，由于HT29细胞的缺失，使得Caco-2细胞的旁路渗透能力也低于体内状态，为使Caco-2细胞模型具有与小肠上皮相似的粘液层，并获得与体内相似的细胞旁路渗透能力，Constanze等[2]将Caco-2细胞与HT29－MTX按不同比例共培养，结果发现，TEER值〔跨膜电阻值〕较单用Caco-2细胞有所降低，而且水溶性小分子物质经共培养细胞模型的渗透能力高于单纯的Caco-2细胞模型，有利于水溶性小分子物质细胞转运过程的研究。由于Caco-2细胞缺少某些首过代谢酶，而这些酶是影响药物口服吸收和生物利用度的关键酶，Charles等[3]利用重组技术在Caco-2细胞中引入CYPcDNAs，从而提高了CYP3A4和CYP2A6的表达，开拓了Caco-2模型在研究药物首过代谢方面的应用，提高了其体内相关性。由于Caco-2细胞缺少或低表达小肠上皮细胞内的某些药物代谢酶和转运体，因此，有人采用经典的细胞生物学方法诱导药物代谢酶的表达，结果发现，在各种酶诱导剂如苯巴比妥、地塞咪松、β-萘黄酮存在下培养Caco-2细胞的亚克隆细胞，可诱导表达不同的酶系统[4]。如Caco-2细胞的亚克隆TC7细胞经诱导后可增加CYP3A的表达，且高表达与刷状缘相关的水解酶、蔗糖－麦芽糖异构酶，以及牛磺胆酸转运系统；经β-萘黄酮诱导可表达CYP1A1基因亚家族，以及高活性的UPD－葡萄糖醛酸转移酶。这些性质使TC7细胞成为有价值的体外肠道研究模型。另外，有研究发现Caco-2细胞在多孔膜上与100nM1α,25-二羟维生素D3共培养2周后可诱导Caco-2细胞内CYP3A4mRNA的表达，与重组技术一样也能形成一个用以研究药物小肠吸收首过效应的细胞模型[5]。2Caco-2细胞模型在改善口服药物吸收研究中的应用2.1各种药物吸收促进剂的开发研究2.1.1亲水性药物及多肽类药物往往表现出低的口服生物利用度，一个重要原因就是肠上皮细胞的紧密连接使得这些药物经细胞旁路的被动扩散受到限制。最近几年，研究者们致力于开发能够调节肠上皮细胞紧密连接〔但不破坏细胞单层完整性〕从而增加肠通透性的吸收促进剂〔如中链脂肪酸、壳聚糖及其衍生物〕[6]。有研究显示，羟丙基－β环糊精和β－环糊精较壳聚糖更能提高优降糖的溶出度，在Caco-2细胞通透性实验中，将两种环糊精和壳聚糖合用时，出现协同效应，较单用壳聚糖更能增加优降糖的肠上皮通透性[7]。由于壳聚糖只在酸性环境中可溶，而肠腔为中性至碱性，研究者对壳聚糖的结构进行了修饰，将壳聚糖局部季铵化，制成N－三甲基壳聚糖氯化物〔TMC〕，该物质在中性环境下可溶，且仍然具有壳聚糖的黏膜黏附性质〔由于壳聚糖分子中的氨基、羟基可与黏膜中的糖蛋白形成氢键而产生黏附作用〕，能够刺激细胞支架的丝状肌动蛋白重新排列，从而翻开肠上皮细胞的紧密连接，促进亲水性药物和肽类药物经细胞旁路的被动吸收[8]。VenturaCA等[9]采用双氧甲基β－环糊精包合塞来考昔〔一种COX-2抑制剂〕，它们以范德华力互相结合，包合后的塞来考昔较单体具有更高的水溶性和溶出度，且环糊精能够使肠上皮黏膜失去稳定性，从而使塞来考昔经肠上皮的通透性增高。2.1.2口服蛋白质类药物〔如胰岛素〕在经过小肠上皮时往往被上皮细胞的代谢酶水解，从而导致其生物利用度降低，失去疗效，为此，研究者们开始研究一些分子载体来保护并运载药物通过小肠上皮，以确保药物以完整形式发挥其原有疗效。此外，为提高一些水难溶性药物的口服吸收能力，寻找与之相吻合的分子载体研究已在进行之中。2.1.22.1.2.1.1以最近开展了一种称为eligen的技术[10]，该技术使用一些低分子量化合物作为胰岛素转运载体，它们能够与肽类药物以非共价键微弱地结合，从而增加药物亲脂性，使其更易通过小肠上皮。这种作用并不破坏肠上皮细胞的紧密连接，同时还可保护胰岛素不被蛋白酶水解。LiangJF等[11]将胰岛素与一种能够跨细胞的肽〔CPP〕形成杂合体，该杂合体采用一种类似主动转运的机制经肠上皮吸收，其吸收效率较单用胰岛素提高6～8倍，且能够保护胰岛素不被蛋白酶降解。MaoS等[12]将胰岛素与PEG－三甲基壳聚糖通过壳聚糖多聚物的自组装作用制成一种小分子量超微共聚体〔每个直径200～400nm，带正电荷，胰岛素荷载率可达90％〕，通过Caco-2细胞对其的胞吞作用促进胰岛素的摄取。LimCJ等[13]将胰岛素连接到转铁蛋白〔Tf〕低聚体和转铁蛋白单体上，形成的杂合体分别为Agg-Tf-S-S-In、Mono-Tf-S-S-In,前者由于能够使转铁蛋白受体TfR发生交联作用，从而较后者更能促进Tf-TfR复合物向Caco-2细胞内转运，并能使细胞内的胰岛素蓄积量升高，促进胰岛素的吸收，更好地发挥降血糖的作用；而且转铁蛋白低聚体与胰岛素的杂合体能够缓慢持续地释放胰岛素，提示它作为蛋白和肽类药物缓释载体的可能性。2.1.2.1.2脂质体作为一种有效的分子载体，广泛应用于肽类药物的保护及运载。王琰等[14]研究了脂质体包裹胰岛素、壳聚糖包覆脂质体胰岛素对胰岛素透过Caco-2细胞的促进作用，结果显示，脂质体,特别是壳聚糖均可以增加胰岛素的通透量。脂质体可通过破坏脂质双分子层的有序排列,使其紊乱而增加所负载物质的穿透生物屏障的能力,进而改变其通透性，而脂质体微囊的内水相还能保护胰岛素的结构和构象；由于壳聚糖带有正电荷,而细胞带有负电荷,壳聚糖包覆脂质体后可能促进药物的定向移动,使Caco-2细胞外表的药物浓度局部增加,从而促进药物向细胞内转运，到达促进吸收作用。在采用Caco-2细胞模型研究人表皮生长因子〔rhEGF—肽类药物〕治疗胃溃疡的实验中，LiH等[15]发现，脂质体包裹后的人表皮生长因子〔rhEGF—肽类药物〕向BL侧(基底侧)转运的速率较单用rhEGF时转运速率低，但由于脂质体的保护作用，使得rhEGF不被酶水解，从而脂质体包裹后的药物治疗胃溃疡会显示出更好效果。SongKH等[16]研究发现，鲑降钙素与外表活性剂〔如牛磺脱氧胆酸钠—NaTDC〕合成的脂质体前体药物，能够使Caco-2细胞单层流态化，同时TDC与鲑降钙素形成亲脂的离子对，也能加速鲑降钙素向细胞内的转运，从而提高生物利用度。2.1.2.2水难溶性药物的弱溶解性，限制了其在体内的吸收。为此，研究者们开始寻找针对水难溶性药物的分子载体。FrancisMF等[17]将VitB12残基通过2,2-乙二氧基双乙胺基团连接到葡聚糖-g-聚氧乙烯十六烷基醚〔DEX-g-PEO-C16〕多聚微粒体上，该微粒体能将CsA〔一种水难溶性的免疫抑制剂〕包合入其疏水核中〔包合率达8.5%w/w〕，从而到达增大水溶性的作用。Caco-2细胞转运实验结果也说明，经VitB12修饰的CsA包合物的PappAP-BL(细胞单层顶端至基底端的表观通透系数)值显著高于未修饰的CsA包合物。PrabhuS等[18]研究发现，水溶性较小的非甾体抗炎药吡罗昔康〔PXCM〕与磷脂载体DMPC〔二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱〕制成的固态分散体，能够显著提高PXCM的溶解度与溶出速率；在该固体分散体中再参加一定量的PEG4600，可使PXCM的释放更加快速。而且，两种处理方式皆可促进PXCM在Caco-2细胞内的转运。2.2为改善药物吸收对其进行化学结构的修饰为增加药物的亲脂性从而提高在小肠上皮的吸收，适当的化学结构修饰是必要的，制成酯质前体药物是目前采用最为广泛的方法，该前体药物进入小肠上皮后可在代谢酶作用下复原成原药，从而发挥药效。LandowskiCP等[19]将5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷分别制成两种氨基酸单酯，即5’-L-异亮氨酸单酯和5’-L-缬氨酸单酯。研究显示，异亮氨酸单酯表现出更好的化学稳定性和酶稳定性—能够保护5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷的糖苷键不被胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸酶水解；同时，与原药相比，经修饰后的酯类前药经PEPT1载体在Caco-2细胞内的转运也显著提高，从而提高了原药的口服吸收和治疗指数。2-溴-5,6-二氯-1-(β-D-呋核亚硝脲)苯并咪唑〔BDCRB〕是有效的人巨细胞病毒选择性抑制剂，但由于其在体内很快被代谢，所以缺乏临床应用价值。有研究发现[20]，将BDCRB制成氨基酸酯类前药如1-天冬氨酸-BDCRB，能够防止BDCRB被其代谢酶水解，从而提高其经Caco-2细胞的吸收转运。此外，氨基酸与BDCRB形成的酯键水解过程为一限速步骤，可使BDCRB缓慢持久地释放，从而提高其在体内的分布。3Caco-2细胞模型在药食相互作用研究中的作用近年，越来越多的研究者采用Caco-2细胞模型研究药物间相互作用，而对药食相互作用研究甚少。现今，有研究者也开始将注意力转移到日常饮食对药物口服吸收的影响上。饮茶人群的日益增加，使得茶叶渐渐成为药食相互作用中备受关注的物质。MonteiroR等[21]初步研究了绿茶和红茶对有机阳离子—3H-MPP+〔由于药物中主要成分往往以有机阳离子的形式存在〕经Caco-2细胞转运的影响，发现绿茶和红茶均能增加3H-MPP+在Caco-2细胞内的吸收。饮食中的多酚类物质无处不在，它们被认为有利于人体健康，SaitoY等[22]研究了饮食中的几个多酚类成分阿魏酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸对抗糖尿病药—那格列奈经小肠吸收的影响，发现它们以不同的方式影响那格列奈/H+转运系统，从而抑制那格列奈的小肠吸收。另外有研究[23]发现，食物中的多酚类在Caco-2细胞中可以代谢为MRP-2的底物，能够与OTA〔赫曲毒素A—一种经食物传播的真菌毒素〕竞争MRP-2，从而抑制了MRP-2对OTA的外排解毒作用，不利于人体健康。饮食中常见的黄酮类成分能够影响小肠的分泌外排作用，OferM等[24]研究了六种黄酮类物质〔橙皮素、槲皮素、山柰酚、绣线菊苷、异槲皮苷、柚皮素〕对P-gp底物他林洛尔经Caco-2细胞的分泌外排作用的影响，发现这六种黄酮类均能抑制P-gp对他林洛尔的外排作用，但并不是与他林洛尔竞争P-gp的结合位点。4Caco-2细胞模型在中药研究中的应用Caco-2细胞模型在中药吸收研究中的应用更是近年才见报道。由于大局部中药成分的吸收过程和机制还未明确，因此Caco-2细胞模型在中药口服吸收研究方面具有广泛应用前景。NishimuraN[25]发现小柴胡汤与降血糖药甲苯磺丁脲合用，在给药后的早期阶段可以提高甲苯磺丁脲经小肠上皮黏膜的通透性〔使用Caco-2细胞模型〕，增强其降血糖的作用。其后小柴胡汤将促进甲苯磺丁脲在Caco-2细胞内的主动转运，抑制其经细胞旁路的被动扩散，同时,随着小柴胡汤剂量增大，甲苯磺丁脲的吸收速率也随之提高。WangY等[26]研究了银杏叶提取物中的黄酮类化合物—槲皮素、山柰酚、异鼠李素在Caco-2细胞模型上的转运机制，测得Papp,B-A值〔细胞单层基底端至顶端的表观通透系数〕高于Papp,A-B值〔P<0.01〕，当P-gp抑制剂维拉帕米存在时，槲皮素、山柰酚、异鼠李素在细胞内的浓度增高，推测槲皮素、山柰酚、异鼠李素均为P-gp的底物，P-gp的外排作用将降低槲皮素、山柰酚、异鼠李素在体内的生物利用度。谢海棠等[27]运用Caco-2细胞模型,观察了人参皂苷Rg3的摄取及代谢情况，发现Caco-2细胞对人参皂苷Rg3的摄取呈现时间及剂量依赖性,而且,代谢抑制剂叠氮钠及2,4－二硝基酚的参加使得摄取速率明显降低(与对照组相比P<0.01)，而人参皂苷Rg3在肠道中的代谢可能是其生物利用度低的原因之一。关溯等[28]研究了隐丹参酮在Caco-2细胞模型中的吸收机制，发现隐丹参酮从单层细胞层顶端到基底端的转运速率〔Papp,A-B值〕大于基底端到顶端的转运速率〔Papp,B-A值〕,随着时间和药物浓度的增加,药物吸收呈饱和趋势,且可被其结构类似物丹参酮竞争性抑制，提示隐丹参酮在Caco-2细胞模型中的吸收主要是由载体介导的主动转运,且该主动转运的载体位于Caco-2细胞单层的顶端。5结语Caco-2细胞模型自80年代起就被广泛应用于药物的吸收、代谢、毒性方面的研究。早期研究者们常用此模型研究口服药物在小肠的吸收转运机制、预测被动扩散药物在体内的吸收、评价吸收过程中的药物相互作用及药物的高通量筛选等方面，对药物的Ⅰ相、Ⅱ相代谢及药物毒性的研究也有涉及。近年来，该模型在研究如何促进低口服生物利用度药物在小肠的吸收及药食相互作用等方面得到越来越广泛的应用。另外，将Caco-2细胞模型用于中药复方及有效成分口服吸收的研究趋势也值得关注。REFERENCES[1]CHONGS,SANDRAAD,RICHARDAM.Evaluationofbiocoatintestinalepitheliumdifferentiationenvironment(3-Dayculturedcaco-2Cells)asanabsorptionscreeningmodelwithimprovedproductivity[J].PharmRes,1997,14:1835-1837.[2]CONSTANZEH,PETERL.Caco-2versusCaco-2/HT29-MTXCo-culturedCellLines:PermeabilitiesViaDiffusion,Inside-andOutside-Directedcarrier-mediatedTransport[J].JPharmSci,2000,89:63-75.[3]CHARLESLC,BRUCEWP,HUM.DevelopmentofCaco-2cellsexpressinghighlevelsofcDNA-derivedcytochromeP4503A4[J].PharmRes,1996,13:1635-1641.[4]WANGCH,QIUZY.DevelopmentofResearchesinCaco-2CellMode[J].JBiomedEng(生物医学工程学杂志),2005,22(3):633-636.[5]AIBAT,SUSAM,FUKUMORIS,etal.TheeffectsofcultureconditionsonCYP3A4andMDR1mRNAinductionby1alpha,25-dihydroxyvitaminD(3)inhumanintestinalcelllines,Caco-2andLS180[J].DrugMetabPharmacokinet,2005,20(4):268-74.[6]CANO-CEBRIANMJ,ZORNOZAT,GRANEROL,etal.Intestinalabsorptionenhancementviatheparacellularroutebyfattyacids,Chitosansandothers:atargetfordrugdelivery[J].CurrDrugDeliv,2005,2(1):9-22.[7]ZERROUKN,CORTIG,ANCILLOTIS,etal.Influenceofcyclodextrinsandchitosan,separatelyorincombination,onGlyburidesolubilityandpermeability[J].EurJPharmBiopharm,2006,62(3):241-246.[8]VANDERMERWESM,VERHOEFJC,VERHEIJDENJH,etal.Trimethylatedchitosanaspolymericabsorptionenhancerforimprovedperoraldeliveryofpeptidedrugs[J].EurJPharmBiopharm.2004,58(2):225-35.[9]VENTURACA,GIANNONEI,PAOLINOD,etal.Preparationofcelecoxib-dimethyl-beta-cyclodextrininclusioncomplex:characterizationandinvitropermeationstudy[J].EurJMedChem,2005,40(7):624-31.[10]MALKOVD,ANGELOR,WANGHZ,etal.Oraldeliveryofinsulinwiththeeligentechnology:mechanisticstudies[J].CurrDrugDeliv,2005,2(2):191-7.[11]LIANGJF,YANGVC.Insulin-cellpenetrateingpeptidehybridswithimprovedintestinalabsorptionefficiency[J].BiochemBiophysResCommun,2005,335(3):734-8.[12]MAOS,GERNERSHAUSO,FISCHERD,etal.UptakeandTransportofPEG-Graft-Trimethyl-ChitosanCopolymer-InsulinNanocomplexesbyEpithelialCells[J].PharmRes,2005,22(12):2058-68.[13]LIMCJ,SHENWC,etal.Comparisonofmonomericandoligomerictransferringaspotentialcarrierinoraldeliveryofproteindrugs[J].JControlRelease,2005,106(3):273-86.[14]WANGY,LIZR,PANFY,etal.AstudyontranscellulartransportationofinsulinliposomesusingCaco-2cellmode[J].ChinesePharmacologicalBulletin(中国药理学通报),2005,21(1):78~81.[15]LIH,ANJH,PARKJS,etal.Multivesicularliposomesfororaldeliveryofrecombinanthumanepidermalgrowthfactor[J].ArchPharmRes,2005,28(8):988-94.[16]SONGKH,CHUNGSJ,SHIMCK.Enhancedintestinalabsorptionofsalmoncalcitoninfromproliposomescontainingbilesalts[J].JControlRelease,2005,106(3):298-308.[17]FRANCISMF,CRISTEAM,WINNIKFM.ExploitingthevitaminB12pathwaytoenhanceoraldrugdeliveryviapolymericmicelles[J].Biomacromolecules,2005,6(5):2462-7.[18]PRABHUS,ORTEGAM,MAC.Novellipid-basedformulationsenhancingtheinvitrodissolutionandpermeabilitycharacteristicsofapoorlywater-solublemodeldrug,piroxicam[J].IntJPharm,2005,301(1-2):209-16.[19]LANDOWSKICP,SONGX,LORENZIPL,etal.Floxuridineaminoacidesterprodrugs:enhancingCaco-2permeabilityandresistancetoglycosidicbondmetabolism[J].PharmRes,2005,22(9):1510-8.[20]LORENZIPL,LANDOWSKICP,SONG,etal.Aminoacidesterprodrugsof2-bromo-5,6-dichloro-1-(beta-D-ribofuranosyl)benzimidazoleenhancemetabolicstabilityinvitroandinvivo[J].JPharmacolExpTher,2005,314(2):883-90.[21]MONTEIROR,CALHAUC,MARTELF,etal.ModulationofMPP(+)uptakebyteaandsomeofitscomponentsinCaco-2cells[J].NaunynSchmiedebergsArchPharmacol,2005,372(2):147-52.[22]SAITOY,ITAGAKIS,OTSUKAY,etal.Substratespecificityofthenateglinide/H(+)cotransportsys