饲料中辣椒红的测定 高效液相色谱法 编制说明

饲料中辣椒红的测定高效液相色谱法编制说明一、工作简况根据《国家标准化管理委员会关于下达2021年第四批推荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通知》（国标委发[2021]41号），“饲料中辣椒红的测定高效液相色谱法”标准制定项目计划编号20214681-T-469，起草单位为四川威尔检测技术股份有限公司、山东省畜产品质量安全中心、山东省饲料兽药质量检验中心。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。辣椒红色素，又名辣椒红，是从辣椒中提取的天然着色剂，主要着色成分为辣椒红素和辣椒玉红素，属类胡萝卜素，占总量的其在饲料中的应用可以促进动物健康、提高免疫力、增加产蛋量和肉蛋品质。添加天然辣椒红色素不仅可以感官上刺激动物的食欲和提高饲料的消化利用率。天然辣椒红色素不仅可以促进动物免疫功能的提高，增强机体抵抗力，它还具有一定的抗炎作用，缓解动物身体的炎症反应和免疫应激反应。添加天然辣椒红色素不仅可以提高动物的产蛋量和肉质品质，还可以提高动物肉品的抗氧化能力和按照农业部2045号公告《饲料添加剂目录》规定，辣椒红为着色剂类的饲料添加剂，适用范围为家禽。按照农业部2625号公告规定，辣椒红在家禽饲料中的最高限量为80mg/kg。为指导饲料生产企业和用户规范使用饲料添加剂辣椒红，避免辣椒红在家禽饲料中超量适用，或者在非家禽饲料中超范围使用，有必要制定“饲料中辣椒红的测定”农业行业标准，可有效规范指导饲料生产、保证饲料产品的质量安全、保护人民群众身体健康，同时为饲料管理部门查阅国内外相关资料，目前测定辣椒红的方法主要有薄层色谱法、比色法和液相色谱法。薄层色谱法仅能定性和半定量；比色法可以定量，但由于其它色素如叶黄素等在同一波长处也有吸收，使得测定结果不能准确反映辣椒红的含量；液相色谱法可以使得辣椒2022年3月，山东省畜产品质量安全中心组织各起草单位召开线上标准制定启动会，会上详细研讨了标准制定路线，明确各起草单位工作分工，山东省畜产品质量安全中心负责技术路线的制定和实施，承担辣椒红素和辣椒玉红素检测方法的开发、样品检测和数据汇总分析，以及标准文本和编制说明等材料的编写等工作；四川威尔检测技术股份有限公司负责负责整个标准的工作调度等；山东省饲料兽药质量检验中心、广州智特奇生物科技股份有限公司、晨光生物科技集团股份有限公司负责样品收集和文献资料的查阅等工1.3.2标准修订技术路线和方案制定2022年7月，标准编制小组查阅了国内外有关标准文献资料，同时调研国内主要辣椒红生产企业、使用企业等标准方法采用情况，制定了标准制定内容和技术路线方案，确定了标准制定的主要内容、技术路线(见图1)、分工、完成时限等。方法适用范围方法适用范围色谱方法开发方法学考察、实验数据处理样品收集、方法适用性考察方法验证图1标准制定技术路线图2022年8月~2023年8月，开展样品收集、方法学研究和实际样1.3.4编写编制说明和征求意见稿2023年9月~11月，标准编制小组完成标准文本、编制说明定向二、标准编制原则和主要技术内容确定的依据2.1标准编制原则准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》以及GB/T20001.4-2015《标准编制规则第4部分：试验方法标准》的规定和要求进行(1)遵循国家颁布的相关法律法规；(2)有关国家或行业标准；(3)国内外有关标准和参考文献；（4）标准编制小组调研和实测的样品检测数据。经查阅相关标准和文献，辣椒红中辣椒红素和辣椒玉红素易溶于有机溶剂，在400nm-600nm范围内有紫外吸收，检测仪器主要为分光光度仪和高效液相色谱仪等仪器设备。因为分光光度法是基于光吸收信号的检测方法，本身并不具有分离功能，在某一波长下测得的吸光度值是所有物质的吸光度之和，因此，并不能准确定量某中规定，辣椒红的有效成分为辣椒红素和辣椒玉红素，在配合饲料中最高限量为80mg/kg（以辣椒红素计见表1）。所以，要定性表1农业部2625号公告中辣椒红素和辣椒玉红素使用规定有效成分为（Capsanthin，CHO)和辣椒玉红素,CHO）类胡萝卜素总量≥中辣椒红素和辣椒玉红素总量占类胡萝卜素总同时使在配合饲料中的总量不得超素和辣椒玉红素色谱峰的光谱图，如图2。结果表明，辣椒红素和辣椒玉红素均在波长475nm附近有最大吸收峰，因此 A B图2辣椒红素和辣椒玉红素标准溶液光谱图注：A.辣椒红素；B.辣椒玉红素分别考察了三种流动相对辣椒红素和辣椒玉红素出峰时间和峰形的影响。当流动相结果见表2。结果表明，乙腈作为流动相使用时，目标峰出峰时间太快，在2min以内，溶剂峰等杂峰对其影响色谱柱上有较强的保留。乙腈+水梯度洗脱，将出峰时间控制在3表2流动相考察条件色谱条件流动相组成流动相比例（%）流速（mL/min）流动相1流动相275+25流动相3梯度洗脱表3梯度洗脱程序时间（min）乙腈（%）水（%）0.00752506.0006.1075257525色谱柱温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有一定的影响。分别考察色谱柱温度为25℃、30℃、35℃和40℃时辣椒红素、辣椒玉红素液相色谱峰形和分离情况，结果见图49。考察结果表明，随着色谱柱温度的升高，辣椒红素、辣椒玉红素的保留时间变化不明显，系统压力降低。在以上条件中，标化合由于辣椒红素和辣椒玉红素的LogP分别为9.90和7.97，所以它们在反相色谱柱上能够保留并被洗脱。本方法比较了实验室反相色谱中常用的两根短色谱柱，分别是柱长100mm、内径4.6mm、2.7µm的C8色谱柱，进行色谱柱考察。在乙腈/水的梯度洗脱程序下，检测波长为475nm，柱温为35℃时，两根色谱柱对辣椒红素和辣椒玉红素的保留情况相当，都能够实现完全分离和良好峰型。在上述色谱条件下，考察不同浓度辣椒红素、辣椒玉红素标准工作溶液的保留时间的精密度和稳定性，结果见表4。结果表明，不同浓度辣椒红素、辣椒玉红素标准工作溶液保留时间的RSD值均小于0.4%。在所选择的色谱条件下，实际样品中的色谱图，辣椒红素、辣椒玉红素的分离度、稳定性和专属性满足定性和定量测定要表4辣椒红素和辣椒玉红素标准溶液精密度试验待测保留时间(min)平均平行1素素保留时间(min)平均平行1素素辣椒红素，分子式为C₄oHs₆O₃,分子量为584.85,化学结构式如图3所示。辣椒玉红素，分子式为C₄oHs₆O₄,分子量为600.85,图3辣椒红素结构式辣椒红色素是以辣椒为原料，采用科学方法提取、分离、精制而成的天然色素。主要成份为辣椒红素和辣椒玉红素，为深红色油溶性液体，色泽鲜艳，着色力强，耐光、热、酸、碱，且不受金属离子影响；溶于油脂和乙醇，亦可经特殊加工制成水溶性或水分散从图3、图4可以看出，辣椒红素和辣椒玉红素均属于弱极性化合物。结合相关文献和标准，我们选取基质较为复杂的蛋鸡配合饲料2g,空白基质加标量约为500μg/kg,分别使用乙腈、80%乙腈水溶液、5%甲酸乙腈、甲醇、5%甲酸甲醇、80%甲醇水溶液作为溶剂进行提取，上机测定，计算其回收率，结果见下表5。表5蛋鸡配合饲料不同提取溶剂回收率试验结果(n=3)平均回收率(%)乙腈水5%甲乙腈甲醇5%甲酸甲醇水12由表4中回收率结果可知，乙腈和甲醇提取的回收率相当，乙腈水的提取回收率最低，这可能和辣椒红色素在有机溶剂中的溶解程度有关。考虑到操作简单以及环境影响程度，本实验考虑采用乙蛋鸭配合饲料、蛋鸭预混料、蛋鸡浓缩料和蛋鸭浓缩料各2g，添加成浓度约为500μg/kg，考察乙腈对其提取效率，结果见表6。结果表明，在所选基质中，乙腈均具有良好的提取效率，因此最终选择表6乙腈提取回收率试验结果（n=3）序号待测组分平均回收率（%）蛋鸡配合饲料蛋鸡预混料蛋鸭配合饲料蛋鸭预混料蛋鸡浓缩料蛋鸭浓缩料1辣椒玉红素84.683.482.286.579.888.72辣椒红素80.781.679.681.783.681.9为了验证提取体积对测定结果的影响，实验考察了采用10mL第2次乙腈提取到的目标物含量在第一次提取的5试剂和时间且不影响实验结果的原则，10mL乙腈提取1次即可满表7不同提取次数回收率试验结果（n=3）序号待测组分平均回收率（%）第1次提取第2次提取1辣椒玉红素92.43.42辣椒红素91.52.7为了验证不同提取方式对测定结果的影响，实验考察了涡旋10min和先涡旋1min再超声10min提取的回收率情况，结果见表8。结果有较为明显的改善。由于饲料基质的复杂性，提取的难易程度不同，为了实验整体效果，本方法采用先涡旋1min再超声10min12为了进一步考察提取时间对测定结果的影响，加入10mL乙腈样品回收率。结果见表9。实验结果表明，随着提取时间增加，回收率无明显增加。为保证不同类型样品的提取效率，且综合考虑时表9不同提取时间回收率试验结果（n=3）序号待测组分平均回收率（%）5min10min15min1辣椒玉红素83.485.684.12辣椒红素81.280.281.7已有的实验结果表明，用乙腈提取后的样品，经高速离心后，溶液澄清，透明度好，经上机检测后，色谱图比较简单，杂质干扰峰较少，且不影响目标物检测。为了进一步考察净化条件的影响，将乙腈提取后的样品溶液用QuEChERS方式净化后，离心，取上清液上机，所得结果与乙腈提取后直接离心上机的结果相比，回收率损失约为15%～20%，说明净化过程会引起目标物的损失。结果见表10。基于直接提取上机的效果良好，所以本方法采用乙腈提取后表10净化实验对回收率的影响（n=3）处理方法平均回收率（%）（100μg/kg）平均回收率（%）（500μg/kg）辣椒玉红素辣椒红素辣椒玉红素辣椒红素QuEChERS净化76.764.773.867.6只提取95.082.490.381.3最终确定的样品提取处理方法如下：称取试样2g（精确至0.1（如果粘稠加一颗陶瓷均质子超声10min，于8000r/min离心5min。取0.8mL上清液，加入0.2mL水，涡旋混合均匀。用微孔滤为确保检测方法的准确性，依据目标化合物理化性质，对其标准储备溶液稳定性进行验证。将目标化合物配制成0.10mg/mL标准储备溶液，2℃~8℃保存。分别在0天、14天、1个月取出标准储备溶液稀释上机，同时新配标准储备溶液，配制系列标准溶液，用液相色谱仪测定浓度，考察其稳定性，结果见表11。结果表明，当测试时间为1个月时，待测物峰面积稳定，无明显降解和变化。因此为保证标准溶液稳定性，减少测试误差，并参照GB/T27404-表11标准储备溶液稳定性试验结果测试时间辣椒红素（mg/mL）辣椒玉红素（mg/mL）0.100.100.0990.09930天0.0980.097准确移取辣椒红素、辣椒玉红素标准储备溶液适量，用80%乙腈水溶液逐级稀释成浓度为0.02g/mL、0.1g/mL、0.2g/mL、色谱仪测定，临用现配。以标准溶液中待测组分的色谱峰面积为纵坐标，以待测组分的浓度为横坐标，绘制标准曲线，辣椒红素、辣椒玉红素线性范围、回归方程及相关系数（r2）结果见表12。结果表12标准工作曲线线性范围、回归方程及相关系数序号待测组分线性范围（ng/mL）2r1辣椒玉红素20-5000y=133.27x-2.37350.99992辣椒红素20-5000y=133.27x-2.37350.9989在仪器的最佳条件下，分别取辣椒红素、辣椒玉红素混合标准定性测定：以保留时间定性，试样溶液中辣椒红素、辣椒玉红素保留时间应与标准系列溶液（浓度相当）中辣椒红素、辣椒玉红定量测定：以辣椒红素、辣椒玉红素的浓度为横坐标，色谱峰面积（响应值）为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。试样溶液中待测物的浓度应在标准曲线的线性范围内。如超在上述色谱条件下，辣椒红素、辣椒玉红素的标准溶液液相色将仪器条件优化至最佳，确定方法的检出限和定量限，具体操添加适量标准溶液于空白样品中，按照上述确定的方法和条件处理后供高效液相色谱仪测定，结合称样质量、提取液体积、净化和上机溶液体积等，依据分析物信噪比S/N>3,确定方法检出限为0.05mg/kg,依据分析物信噪比S/N>10,确定方法定量限为0.1根据信噪比计算得到的定量限进行空白基质加标试验，结果见表13~表20。表13蛋鸡产蛋期配合饲料定量限加标回收试验结果添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均率（%）批内RSD（%）批间RSD（%）辣椒素Ⅰ97.386.898.296.798.296.55.285.86Ⅱ96.399.798.292.699.14.55Ⅲ96.185.797.185.794.790.591.65.58辣椒红素Ⅰ96.796.696.298.595.999.05.617.33Ⅱ98.592.999.399.797.498.43.21Ⅲ80.588.797.389.482.391.588.36.97表14蛋鸡配合饲料定量限加标回收试验结果添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均批内RSD批间RSD辣椒素Ⅰ96.897.496.498.697.2率率98.5（%）（%）Ⅱ99.592.897.498.598.898.74.01Ⅲ86.297.198.498.096.099.695.9辣椒红素Ⅰ98.797.396.096.897.899.24.695.76Ⅱ99.496.998.799.03.30Ⅲ85.998.386.893.398.491.992.45.84表15蛋鸭配合饲料定量限加标回收试验结果添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均率（%）批内RSD（%）批间RSD（%）辣椒素Ⅰ97.498.099.798.698.799.42.284.18Ⅱ99.896.799.696.496.85.38Ⅲ92.499.996.394.597.897.74.68辣椒红素Ⅰ98.697.398.698.992.998.33.522.78Ⅱ99.398.396.398.198.199.23.00Ⅲ98.397.296.399.797.898.62.13表16蛋鸭产蛋期配合饲料定量限加标回收试验结果添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均批内RSD批间RSD辣椒素Ⅰ99.598.597.296.4（（14.20Ⅱ97.598.796.098.997.398.72.78Ⅲ89.292.095.994.593.597.893.83.21辣椒红素Ⅰ90.196.697.298.396.696.63.653.06Ⅱ96.797.299.397.499.998.92.32Ⅲ95.492.598.894.597.896.52.95表17宠物（犬）配合饲料添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均率批内RSD（%）批间RSD辣椒素Ⅰ97.595.998.198.796.199.04.524.06Ⅱ96.999.396.195.297.498.33.54Ⅲ98.596.688.399.797.198.796.54.32辣椒红素Ⅰ99.297.098.397.43.955.01Ⅱ97.898.191.798.197.992.095.93.30Ⅲ86.898.292.887.996.696.993.25.24表18宠物（猫）配合饲料定量限加标回收试验结果添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均批内RSD批间RSD辣椒素Ⅰ97.896.396.797.195.7率率98.75.69Ⅱ96.890.692.491.194.797.393.83.07Ⅲ89.781.494.398.199.594.392.97.09辣椒红素Ⅰ96.799.499.695.36.685.87Ⅱ97.292.598.790.889.787.592.74.72Ⅲ92.698.397.997.095.998.396.72.27表19蛋鸡预混合饲料定量限加标回收试验结果添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均率（%）批内RSD（%）批间RSD（%）辣椒素Ⅰ97.199.897.69896.999.33.655.66Ⅱ92.691.198.193.897.15.72Ⅲ81.697.896.998.092.995.293.76.66辣椒红素Ⅰ98.290.798.298.08.007.45Ⅱ96.498.493.592.697.197.45.13Ⅲ85.189.997.193.697.484.291.26.33表20蛋鸭预混合饲料定量限加标回收试验结果添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均批内RSD批间RSD辣椒素Ⅰ96.488.297.398.198.1率率97.96.67Ⅱ96.798.997.197.396.098.94.24Ⅲ85.396.582.496.696.691.891.56.88辣椒红素Ⅰ94.998.397.798.597.698.93.865.27Ⅱ97.788.298.796.187.795.36.50Ⅲ96.491.387.398.993.298.594.34.80结果表明，辣椒玉红素平均回收率为91.5%～100%，批内变辣椒红素平均回收率为88.3%～100.9%，批内变异系数为蛋鸡配合饲料、蛋鸭配合饲料、蛋鸭产蛋期配合饲料、宠物（犬）配合饲料、宠物（猫）配合饲料、蛋鸡预混合饲料、蛋鸭预混合饲料分别进行加标回收试验，每种试样采用不同的添加浓度，每个添表21蛋鸡产蛋期配合饲料添加回收添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均回收率（%）批内RSD（%）批间RSD（%）辣椒玉红素Ⅰ97.386.898.296.798.296.55.285.86Ⅱ96.399.798.292.699.14.55Ⅲ96.185.797.185.794.790.591.65.58辣椒红素Ⅰ96.796.696.298.595.999.05.617.33Ⅱ98.592.999.399.797.498.43.21Ⅲ80.588.797.389.482.391.588.36.97500辣椒玉红素Ⅰ85.989.492.795.688.989.790.43.713.58Ⅱ95.387.290.391.589.289.690.53.02Ⅲ84.487.596.388.589.289.789.34.40辣椒红素Ⅰ94.389.893.394.490.184.391.04.255.22Ⅱ82.789.293.481.990.994.988.8Ⅲ83.391.788.582.692.495.289.05.75辣椒玉红素Ⅰ87.893.281.692.289.894.189.85.156.28Ⅱ90.889.792.078.280.584.686.06.70Ⅲ94.089.486.180.186.078.185.66.85辣椒红素Ⅰ85.581.584.283.888.991.185.84.134.25Ⅱ85.281.392.687.382.788.486.34.76Ⅲ84.990.883.889.289.492.888.53.92表22蛋鸡配合饲料添加回收添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均回收率（%）批内RSD（%）批间RSD（%）辣椒玉红素Ⅰ96.897.496.498.697.298.53.13Ⅱ99.592.897.498.598.898.74.01Ⅲ86.297.198.498.096.099.695.9辣椒红素Ⅰ98.797.396.096.897.899.24.695.76Ⅱ99.496.998.799.03.30Ⅲ85.998.386.893.398.491.992.45.84500辣椒玉红素Ⅰ90.395.094.191.784.392.491.34.184.65Ⅱ87.789.588.993.190.989.389.92.09Ⅲ93.978.385.691.894.192.889.47.03辣椒红素Ⅰ94.487.295.889.194.590.091.83.833.17Ⅱ95.588.295.894.990.393.693.13.34Ⅲ87.590.591.793.394.092.391.62.55辣椒玉红素Ⅰ80.390.081.592.384.486.985.95.504.31Ⅱ89.681.491.583.982.487.886.14.79Ⅲ86.388.883.987.785.891.287.32.92辣椒红素Ⅰ81.483.789.488.880.881.984.34.533.94Ⅱ81.880.487.388.185.387.785.13.85Ⅲ85.284.081.780.089.287.684.6表23蛋鸭配合饲料添加回收添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均回收率（%）批内RSD（%）批间RSD（%）辣椒玉红素Ⅰ97.49899.798.698.799.42.284.18Ⅱ99.896.799.696.496.85.38Ⅲ92.499.996.394.597.897.74.68辣椒红素Ⅰ98.697.398.698.992.998.33.522.78Ⅱ99.398.396.398.198.199.23.00Ⅲ98.397.296.399.797.898.62.13500辣椒玉红素Ⅰ89.789.885.196.091.389.290.23.912.99Ⅱ92.495.687.989.492.789.491.2Ⅲ93.692.891.788.489.991.891.42.09辣椒红素Ⅰ93.584.492.572.982.695.987.09.986.64Ⅱ89.895.894.487.093.994.692.63.69Ⅲ91.191.483.689.995.092.890.64.26辣椒玉红素Ⅰ90.482.988.189.590.890.288.73.354.77Ⅱ90.684.790.989.981.781.086.55.28Ⅲ80.289.581.788.582.681.884.14.67辣椒红素Ⅰ89.184.884.889.381.883.185.53.623.93Ⅱ80.787.088.981.488.987.885.84.36Ⅲ80.688.185.488.183.080.084.24.25表24蛋鸭产蛋期配合饲料添加回收添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均回收率（%）批内RSD（%）批间RSD（%）辣椒玉红素Ⅰ99.598.597.296.43.814.20Ⅱ97.598.796.098.997.398.72.78Ⅲ89.292.095.994.593.597.893.83.21辣椒红素Ⅰ90.196.697.298.396.696.63.653.06Ⅱ96.797.299.397.499.998.92.32Ⅲ95.492.598.894.597.896.52.95500辣椒玉红素Ⅰ88.995.787.590.393.395.991.93.873.82Ⅱ91.491.495.290.494.790.792.32.27Ⅲ88.792.085.183.191.490.488.54.08辣椒红素Ⅰ94.190.393.093.587.394.592.13.023.71Ⅱ95.391.588.194.088.789.591.23.23Ⅲ91.991.083.388.792.084.888.64.24辣椒玉红素Ⅰ88.582.089.288.386.081.085.84.28Ⅱ89.082.490.586.980.785.485.84.40Ⅲ86.787.782.682.491.392.687.24.88辣椒红素Ⅰ82.688.681.685.785.486.385.03.004.42Ⅱ80.490.980.085.783.884.084.14.74Ⅲ87.089.184.074.986.284.384.35.87表25宠物（犬）配合饲料添加回收添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均回收率（%）批内RSD（%）批间RSD（%）辣椒玉红素Ⅰ97.595.998.198.796.199.04.524.06Ⅱ96.999.396.195.297.498.33.54Ⅲ98.596.688.399.797.198.796.54.32辣椒红素Ⅰ99.297.098.397.43.955.01Ⅱ97.898.191.798.197.992.095.93.30Ⅲ86.898.292.887.996.696.993.25.24500辣椒玉红素Ⅰ90.192.584.496.988.091.290.54.663.94Ⅱ88.793.688.190.988.482.888.84.03Ⅲ94.488.992.594.190.293.692.32.44辣椒红素Ⅰ94.493.580.995.782.591.189.75.96Ⅱ90.591.789.794.888.393.791.52.69Ⅲ82.390.382.185.281.882.384.03.96辣椒玉红素Ⅰ88.786.472.986.787.582.384.17.005.04Ⅱ88.281.091.087.180.185.685.54.95Ⅲ83.580.785.581.888.083.283.8辣椒红素Ⅰ81.987.189.787.179.988.785.74.584.18Ⅱ89.687.682.780.181.580.083.64.86Ⅲ87.188.787.081.484.982.885.33.29表26宠物（猫）配合饲料添加回收添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均回收率（%）批内RSD（%）批间RSD（%）辣椒玉红素Ⅰ97.896.396.797.195.798.75.015.69Ⅱ96.890.692.491.194.797.393.83.07Ⅲ89.781.494.398.199.594.392.97.09辣椒红素Ⅰ96.799.499.695.36.685.87Ⅱ97.292.598.790.889.787.592.74.72Ⅲ92.698.397.997.095.998.396.72.27500辣椒玉红素Ⅰ92.495.093.493.588.387.991.83.212.93Ⅱ95.492.390.088.793.488.091.33.16Ⅲ93.289.887.288.092.891.190.42.73辣椒红素Ⅰ87.691.395.092.195.989.691.93.434.15Ⅱ98.189.592.295.395.391.793.73.32Ⅲ96.192.884.392.388.485.589.9辣椒玉红素Ⅰ90.685.685.090.283.690.587.63.644.20Ⅱ91.984.387.287.082.985.286.43.64Ⅲ89.692.080.682.291.885.186.95.69辣椒红素Ⅰ86.680.188.386.086.281.184.73.904.39Ⅱ80.891.180.189.886.380.484.85.88Ⅲ83.885.578.285.287.783.083.93.84表27蛋鸡预混合饲料饲料添加回收添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均回收率（%）批内RSD（%）批间RSD（%）辣椒玉红素Ⅰ97.199.897.69896.999.33.655.66Ⅱ92.691.198.193.897.15.72Ⅲ81.697.896.998.092.995.293.76.66辣椒红素Ⅰ98.290.798.298.08.007.45Ⅱ96.498.493.592.697.197.45.13Ⅲ85.189.997.193.697.484.291.26.33500辣椒玉红素Ⅰ92.491.893.590.197.896.493.77.78Ⅱ88.582.381.590.991.693.688.15.74Ⅲ81.181.971.383.992.482.382.28.20辣椒红素Ⅰ95.987.592.883.282.383.387.56.504.80Ⅱ94.691.687.988.290.192.490.82.84Ⅲ92.294.685.392.495.191.44.05辣椒玉红素Ⅰ80.281.391.390.389.892.387.56.104.58Ⅱ86.385.981.489.984.283.385.23.44Ⅲ87.583.582.389.991.288.687.24.07辣椒红素Ⅰ87.180.986.086.685.480.984.53.353.15Ⅱ82.883.984.288.482.286.684.72.80Ⅲ83.285.983.588.989.982.685.73.64表28蛋鸭预混合饲料添加回收添加浓度（mg/kg）待测组分批次回收率（%）平均回收率（%）批内RSD（%）批间RSD（%）辣椒玉红素Ⅰ96.488.297.398.198.197.96.816.67Ⅱ96.798.997.197.396.098.94.24Ⅲ85.396.582.496.696.691.891.56.88辣椒红素Ⅰ94.998.397.798.597.698.93.865.27Ⅱ97.788.298.796.187.795.36.50Ⅲ96.491.387.398.993.298.594.34.80500辣椒玉红素Ⅰ89.987.487.893.688.894.890.43.433.46Ⅱ94.694.187.988.593.190.591.53.16Ⅲ95.195.590.587.287.794.791.84.15辣椒红素Ⅰ89.187.987.187.288.394.289.03.00Ⅱ87.693.795.593.182.691.490.75.26Ⅲ91.795.590.896.088.594.592.83.20辣椒玉红素Ⅰ84.782.187.792.388.491.887.84.524.43Ⅱ91.683.484.987.091.592.188.44.31Ⅲ84.983.481.288.490.582.585.24.23辣椒红素Ⅰ89.782.080.081.382.783.783.24.09Ⅱ84.183.189.982.589.081.685.04.15Ⅲ88.980.987.288.789.184.186.53.83红素平均回收率为81.6%～100.9%，批内变异系数为2.13%~9.98%,批间变异系数为2.78%～7.45%;本方法准确度和精密度良好。不同空白基质加标试验色谱图详见图6~图21。图6产蛋鸭预混合饲料空白图7产蛋鸭预混合饲料加标回收图8产蛋鸡预混合饲料空白图9产蛋鸡预混合饲料加标回收图10蛋鸭配合饲料空白图11蛋鸭配合饲料加标回收图12产蛋鸭配合饲料空白图13产蛋鸭配合饲料加标回收图14蛋鸡产蛋期配合饲料空白图16蛋鸡产蛋期配合饲料2号空白图17蛋鸡产蛋期配合饲料2号加标回收图18宠物(犬)配合饲料空白图19宠物(犬)配合饲料加标回收图20宠物(猫)配合饲料空白图21宠物(猫)配合饲料加标回收在上述色谱条件下，考察其他类胡萝卜素对分析辣椒红素和辣椒玉红素的干扰情况。选择一种市售的饲料添加剂类胡萝卜素产品进行干扰试验。其中，辣椒红素的标识含量为≥5g/kg。在上述液相色谱条件下，其他类胡萝卜素的出峰时间均对辣椒红素和辣椒玉红素的响应无干扰，见图22,且测得的辣椒红素的含量为5.86g/kg,图22干扰试验液相色谱图试验收集蛋鸭配合饲料、蛋鸡配合饲料、肉鸡配合饲料、肉鸭配合饲料、猪配合饲料、鸡浓缩饲料、鸭浓缩饲料、鸡复合预混合饲料、鸭复合预混合饲料、猫粮、犬粮、鱼配合饲料等12种饲料产品，按上述确定的样品提取方法条件和色谱条件测定试样中辣椒红饲料样品种类繁多，添加的各种化学物质范围广，本实验部分仅对常见的饲料产品进行了验证，不同基质样品类型的检测可能会出现不同程度的偏差。依据本试验测定的回收率、精密度，并参照在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差三、试验验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经