核酸理化性质 四川理工学院

4.4核酸和核苷酸的性质(Section4PropertiesofNucleicacidandNucleotide)一、溶解性〔Solubility〕①RNA、Nt、Ns和Base纯品为白色粉末或结晶体。②DNA为纤维状固体。③核酸为极性物质，核苷酸和核苷可溶于水。④核酸大多与蛋白质结合成和蛋白。在不同的盐浓度下，DNA蛋白〔DNP〕和RNA蛋白〔RNP〕溶解度不同。

1核蛋白+1mol/LNaCI→DNP溶解+RNP↓核蛋白+0.141mol/LNaCI→DNP↓+RNP溶解(低盐DNP不溶，高盐RNP不溶)核蛋白在pH4.2〔pH=pI〕时，DNP↓，RNP溶解核蛋白在pH2～2.5〔pH=pI〕时，RNP↓，DNP溶解二、核酸及其组分的两性性质1.碱基解离，第一位都在N上,解离位点：A：在N1解离，G：在N7解离，U：在N3解离，T：在N3解离，C：在N3解离，22.核苷〔Ns〕解离糖的存在使N解离pK值降低，而糖上－OH的解离无足轻重〔pK在12以上〕3.核苷酸〔Nt〕解离Pi有两次解离，pK′＝0.7～1.6pK′＝6.1～6.5Nt含碱基和Pi，为两性电解质，当正、负解离速度相等时，该pH即为pI，〔U、T除外,不带电荷〕pI=(pK′+pK′)/2，pK′为Pi第一解离，pK′为N解离eg.AMPpI=(0.9+3.8)/2=2.35了解Nt的解离及pI，在制备及分析中极有帮助。IPα2IPIPα2IIP32.核苷〔Ns〕解离糖的存在使N解离pK值降低，而糖上－OH的解离无足轻重〔pK在12以上〕3.核苷酸〔Nt〕解离Pi有两次解离，pK′＝0.7～1.6pK′＝6.1～6.5Nt含碱基和Pi，为两性电解质，当正、负解离速度相等时，该pH即为pI，〔U、T除外,不带电荷〕pI=(pK′+pK′)/2，pK′为Pi第一解离，pK′为N解离eg.AMPpI=(0.9+3.8)/2=2.35了解Nt的解离及pI，在制备及分析中极有帮助。IPα2IPIPα2IIP44、核酸分子的解离〔Dissociation〕核酸和多核苷酸链除了末端磷酸残基外，磷酸二酯键中磷酸残基只有一个解离常数，pK1=1.5三、紫外吸收(260nm，定性和定量分析)但分子量差异大，纯质不一，难以用NA重量浓度来表示其消光系数，故常用摩尔磷消光系数.ε(p)—每升溶液中含1mol磷的核酸溶液〔pH=7〕的消光系数。260nm:DNA=7,000～10,000RNA=6,000～8,0005四、核酸的变性与复性〔DenaturationandrenaturationofNA〕〔一〕DenaturationofNA①定义:NA受热、酸碱、有机溶剂、辐射、及尿素等变性剂作用，皆引起变性，所谓变性：氢键断裂，双螺旋结构解开，从而引起紫外｛ε(p)｝增加〔hyperchromieeffect，增色效应〕、失去生物活性、粘度下降〔双股－无规线团〕〔与pr反〕、比旋下降等性质改变的过程叫变性。(与降解不同，无共键的断裂)8DNA的变性(denaturation)变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变DNA变性的本质是双链间氢键的断裂9增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。10

用途：a.作为判断变性，复性的指标变性－hyperchromiceffect〔增色效应，ε(p)〕复性－hypochromiceffect〔减色效应，ε(p)〕b.测NA浓度〔常用〕②热变性及变性温度热引起…变性温度(Tm)—紫外吸收值达最高值的一半时溶液所处的温度(突发过程，相当窄的温度)。或双螺旋结构失去一半时的温度〔meltingtemperature，溶解温度，解链温度〕。DNA，Tm=70～85oC。DNA变性Tm与以下因素有关：11

●样品均一性越均一，温度越窄。是均一性的检验标准

●溶液离子强度增高，Tm值增加●G－C含量pH7.0，0.165MNaCl中DNA的Tm值与G－C含量成正比。其它条件亦相似。可用下面公式计算G-C百分含量：

G－C％＝〔Tm－69.3〕×2.44如某DNATm值在pH7.0、0.165MNaCl中为80ºCG－C〔％〕＝10.7×2.44=26.112当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。

8090100100%50%OD260（254）

Tm

变性温度范围①②③℃融解温度〔meltingtemperature,Tm〕：DNA热变性过程中，紫外吸收到达最大值的一半时溶液的温度称为融解温度〔Tm〕或解链温度、变性温度。实验室常用的方法——热变性13〔1〕变性后理化性质改变DNA溶液的粘度降低浮力密度增加旋光偏振光改变紫外吸收增加〔高色效应〕高色效应〔hyperochromiceffect〕：DNA变性后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。〔2〕变性后的DNA一级结构没有改变。总结：14〔3〕融解温度〔meltingtemperature,Tm〕：DNA热变性过程中，紫外吸收到达最大值的一半时溶液的温度称为融解温度〔Tm〕GC含量越高，Tm越大DNA越长，Tm越大溶液离子强度增高，Tm值增加DNA越纯，相变范围越小

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减色效应〔hypochromiceffect〕:DNA复性时，其溶液OD260降低。16

复性速度常用Cot1/2表示Co：变性DNA浓度(以Ntmol数表示)；t：复性时间〔秒〕。Cot1/2表示DNA复性50％所需时间与DNA浓度的乘积。17在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件〔温度及离子强度〕下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。核酸分子杂交(hybridization)18核酸的杂交1920DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子21核酸探针〔nucleicacidprobe〕:能特异性的探测带某一特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。22

核酸分子杂交(hybridization)由不同来源的核酸单链形成杂化双链的过程234.5Nt类物质的制备及应用一、核酸组分Nt、Ns和Base的制备〔一〕降解方法①酸解NA，直接得碱基〔或无嘌呤酸〕，糖苷键断。Pu>Py〔purine〕〔pyrimidine〕；deoxy>oxy②碱解RNA〔0.3～1MNaOH〕，得2',3'环式Nt，进一步生成2′或3'Nt、Ns(Nt代表核苷酸，Ns代表核苷的缩写〕DNA无2'-OH，不能生成2',3'环式Nt，相对抗碱。

24③酶解限制性内切酶类，以后再讲。外切酶类1.牛脾磷酸二酯酶作用方式:5'-3'外切底物:RNA，DNA，5'-OH专一，3'断裂产物:3'Nt2.蛇毒磷酸二酯酶作用方式:3'-5'外切底物:RNA，DNA，3'-OH专一，5'断裂产物:5'Nt。〔与桔青酶磷酸二酯酶同〕25〔三〕应用1.研究用试剂肌苷用于血液保存，2.强力味精〔鸟苷酸，肌苷酸与味精混合，鲜味增加几十倍〕3.ATP，GTP改善代谢功能；5－FU抗癌作用；聚肌胞=聚肌苷、聚胞苷，抗病毒，是干扰素诱导剂〔肝炎〕……26二、PrperationofNA〔DNAandRNA〕

〔一〕制备NA时注意的几个问题①防止核酸酶的水解加核酸酶抑制剂或去核酸酶激活剂。②防止化学因素的降解提取NA常用酸碱法，但要防止过酸过碱。③防止物理因素的降解高温、机械等作用力破坏NA结构，应该在低温和温和条件下进行。27〔二〕DNA的制备①辛醇－氯仿法Et-OHDNA〔水相〕DNA↓核蛋白溶液＋辛醇－氯仿Pro〔水与氯仿相之间〕②SDS法SDS将Pro变性，与DNA别离③苯酚法苯酚将Pro变性，抑制Nuclease活性。活性DNA在水相↓28〔三〕RNA的制备①粗提方法：苯酚法；稀碱或盐溶液〔与pI联合使用〕。提取不同RNA时，先用离心法别离细胞器，再提取相应的RNA。如rRNA从核糖体中提取，tRNA从细胞质中提取，mRNA从多聚核糖体中提取。②精制方法：分子筛层析，密度梯度离心，DEAE-Sephadex，PolydT亲和柱(精制mRNA，与mRNA尾巴PolyA特异结合)等。

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消化定磷试剂NA(DNA和RNA)+H+有机磷转化为无机磷蓝色产物〔总磷，A650nm～660nm〕核酸磷真实含量＝总磷－无机磷纯核酸含磷量约9.5%，1g磷＝10.5g核酸〔100/9.5〕〔四〕琼脂糖凝胶电泳法〔尤其用于DNA测定和分析〕DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳〔加溴乙锭，插入DNA中使荧光增强〕,荧光强度与DNA含量正比。与标准品对照可测定样品中DNA的量。31

二、NA纯度分析方法：测定双链和单链DNA的吸收光谱；双链向单链转化过程中的光吸收增加〔增色效应〕三、DNA的PAGE①测定DNA、片断和基因的相对分子量大小。常用标准分子量的DNA作对照，计算样品DNA的分子大小。②鉴别分子量相同，但构象不同的DNA在PAGE中的迁移率大小：超螺旋型〔SC)>线形分子〔L〕>开环状分子〔OC〕32

四、核酸分子杂交〔Hybridization〕热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。经典方法：〔现在少用〕〔1〕RNA用同位素标记〔2〕与变性DNA在0.9MNaCl，0.09M乙酸钠中66℃，保温24hr。〔3〕RNase除去未结合RN