核酸测序技术

核酸序列分析Thenucleicacidsequenceanalysis核酸序列分析核酸序列分析，又名核酸测序技术，简称测序（sequencing）。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。

第一代DNA测序技术于1975年由桑格(Sanger)和考尔森(Coulson)开创的链终止法，

1976-1977年由马克西姆(Maxam)和吉尔伯特(Gilbert)发明的化学法(链降解)。在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基。第二代测序技术通常被定义为同步化三磷酸核苷酸的洗脱方法和同步化的光学检测方法的结合。第二代测序技术靠的是连接测序，或者合成测序，包括焦磷酸测序和可逆性的链终止法。

第三代测序技术以将人类基因组测序的成本降到1000美元以下为终极目标，美国国立健康研究院/美国国立人类基因组学研究所(NIH/NIGRI)资助了几个小组以改进第二代测序技术或研发其他的测序方法，包括扫描隧道电子显微镜(TEM)，荧光共振能量转(FRET)，单分子检测(Single-moleculeDetection)和蛋白质纳米孔(ProteinNonopores)的应用。

核酸序列分析1977年，Sanger等人发明了一种测定DNA分子内核苷酸序列的方法（双脱氧链终止法）。桑格(Sanger）吉尔伯特(Gilbert）伯格（Berg）1980年，Sanger与Gilbert和Berg共享诺贝尔化学奖核酸序列分析第一节，第一代DNA测序技术第二节，第二代测序技术第三节，第三代测序技术及发展趋势第一节，第一代DNA测序技术

Sanger双脱氧链终止法Maxam-Gilbert化学裂解法Sanger于1977年在加减法测序的基础上创建了双脱氧链末端合成终止法（chainterminationmethod），简称Sanger法、双脱氧法或酶法。一、基本原理

利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸为测序反应的链终止剂。

POHdNTPddNTP

POHOH

P

P

P

POH在4组相互独立的测序反应体系中，分别加入四种不同ddNTP，其余成分相同。调整每个测序反应中dNTP与ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于待测模板DNA每个可能掺入的位置都有可能发生终止。产生4组分别终止于互补链3′末端的每一个A、G、C和T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测，直接读出新合成DNA链的序列。双脱氧链末端终止法测序原理示意图

二、测序反应体系的组成（一）待测模板1．单链模板DNASanger法使用的经典测序反应是将待测DNA片段克隆于M13mp载体中，得到单链的DNA模板，再按Sanger法进行测序。2．双链模板DNA将待测的DNA片断克隆到质粒载体上，得到含待测DNA克隆片断的双链质粒，通过碱变性处理，再与寡核苷酸引物序列一起退火，然后按Sanger法进行测序。PCR产物（二）引物在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物。不论是单链DNA模板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“通用”引物。通用引物的长度一般为15～30个核苷酸。（三）DNA聚合酶

1．大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）

Klenow片段酶是Sanger法最早使用的DNA聚合酶，具有5′→3′聚合酶和3′→5′外切酶活性，但它催化链延伸反应的能力较差，用它进行测序常产生较高的本底和假带。2．测序酶（sequenase）测序酶是一种经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，消除了3′→5′外切酶活性。该酶活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长DNA的首选酶。3．TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是PCR反应的关键酶，在95℃的高温下保持稳定，可在高温下进行反应，该酶用于测序具有很好的链延伸性能，能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的影响。

（四）放射性核素标记的dNTP一般采用α-32P-dNTP或α-35S-dNTP作为标记物。目前通常采用α-35S-dNTP。

（五）测序产物的凝胶电泳及识读能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNA片段进行有效分离是序列分析成败的关键。三、Sanger双脱氧链终止法的特点1.快速简便，一次反应可测500个以上的碱基序列。2.荧光染料代替放射性核素标记，使该法便于实现自动化分析，能够满足绝大多数DNA样品序列分析的需要。Maxam-Gilbert化学裂解法

化学裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而使N-糖苷键断裂，暴露出的糖环以β-消除反应，在3’和5’位上断裂磷酸二酯键。使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。4种核苷酸的特异裂解和鉴别方法如下：碱基特异性修饰及裂解反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和AC+T肼嘧啶开环六氢吡啶C和TC肼（加盐）胞嘧啶开环六氢吡啶C化学裂解法测序的原理1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C4个反应体系3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列Maxam&GilbertDNA化学降解法

DNA自动化测序系统差别很大，但大都沿用Sanger的双脱氧核苷酸链终止法远离进行测序反应，主要差别在于非放射性标记（荧光标记）和反应产物（标记核苷酸片段）分析系统。目前应用最广泛的自动测序仪是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。四、DNA自动化测序（一）自动DNA测序仪主要构成1，测序反应系统：进行测序反应。2，电泳系统：主要有平板凝胶电泳、毛细管凝胶电泳、微槽管道凝胶电泳等。3，荧光检测系统：其激发能源装置能发射激光以激发样品荧光，然后荧光检测装置能探测和收集荧光信号。4，电脑分析系统：将荧光检测系统收集到的数据，按设定的程序颜色信息转变为碱基序列信息。（二）自动DNA测序仪的种类第一类采用“单染料/四泳道”法：同一种染料，四个独立反应产物分别上样到不通的泳道。第二类采用“四染料/单泳道”法：四种染料，反应产物能在同一个胶道进行分析。(三)自动DNA测序仪工作原理1，一个DNA样本进行四组测序反应，但分别以带有不同荧光的ddNTP作为终止物。每个产物在光激发下会产生不同的荧光。2，四组反应产物混合后，进行一个凝胶泳道或同一个毛细管进行电泳。3，通过荧光DNA装置发射激光，激发泳道中的寡核苷酸片段产生荧光，然后经荧光检测器收集不同的荧光信号。4，收集到的荧光信号由电脑根据设定的程序将颜色信息转变为碱基序列信息。377型遗传分析仪310型遗传分析仪3100遗传分析仪

3730遗传分析仪

五、DNA测序策略DNA的测序策略因待测DNA分子的性质、测序方法和测序目的不同而有所不同。在测序之前，必须根据待测序列区的长度，所要求的测序精确度以及现有设施来制定测序总策略。一、已知序列的确证性测序策略二、未知序列的从头测序策略

一、已知序列的确证性测序策略确证性测序（confirmatorysequencing）是对已知的核酸序列进行鉴定和证实。例如，在临床分子诊断中，对有遗传倾向的k病例检测相关基因有无突变，不仅有助于临床诊断，还有助于探索有关疾病的发病机理及基因突变引起的表型的变化。多数情况下，确证性测序的DNA片段较小，一套反应即可获得双链DNA其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只需对亚克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序。待测DNA片断位于通用引物的测序范围之内时，可按克隆位点两侧的载体序列设计和合成寡核苷酸片段作为“通用引物”；否则，最好的方法是合成一段长度为18-20核苷酸的寡核苷酸引物，与距离待测区约50-100核苷酸的序列互补。二、未知序列的测序策略未知序列DNA的从头测序（denovosequencing）是指确定一个未知DNA序列的准确长度及核苷酸排列顺序。测序策略因待测DNA的长度而异，只有1kb左右的待测DNA可选用定向测序法，过长的DNA可选用随机测序法。（一）随机测序法随机测序法（randomapproach）包括鸟枪法与人工转座子法。其共同特点是无特定方向性，随机对靶DNA进行测序，最后通过计算机拼装而得到完整的序列信息。1．鸟枪法鸟枪法（shotgunstrategy）是利用超声处理、核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）切割或限制性酶切割，将长链DNA随机断裂成适于测序的片段，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，含有子片段的亚克隆扩增后分别进行DNA序列测定，然后将序列重叠排列，确定待测DNA的完整序列。该法所获得的序列由许多序列累积产生，结果准确。但由于测序的亚克隆是随机挑选出来的，使某些序列可能被多次重复测定，而一些序列一直不出现，通常要测定比实际靶DNA所含核苷酸多4～7倍的序列；如果靶DNA含较多的重复序列，计算机将难以进行分析。（二）定向测序法定向测序法（directedsequencing）是指从待测DNA片段的某一端开始按顺序进行测序，直至将待测DNA的序列全部测完。该类方法具有方向性，不会出现大量重复测定的现象。定向测序法主要包括嵌套缺失法和引物步入法。嵌套缺失法（nesteddeletion）是利用工具酶酶解待测DNA，只要控制消化时间，即可产生一组从同一端缺失的长度不一的互套缺失突变体，测定其序列，通过相互重叠部分将相邻片段的序列彼此拼接，如此重叠互套，获得待测DNA的全序列。1．嵌套缺失法产生互套缺失突变体的主要工具酶有核酸外切酶III、核酸酶Bal31、DNA酶I和T4DNA聚合酶。用外切酶Ⅲ构建互套缺失突变体测序方法示意图2．引物步入法引物步入法（primerwalking）是从待测DNA片段的3ˊ端开始，利用载体上的序列设计第一次反应的引物，测定一段DNA序列，然后依次根据前一次测序结果，设计下一次反应引物，循序渐进测序，直至完成，得到靶DNA的全部序列。引物步入法测序原理示意图第二代测序技术

第一代测序技术的缺陷：1，Sanger测序法依赖电泳分离技术；2，无法大批量进行，同时不能微量化；3，代价昂贵，人类基因组计划共耗费30亿多美元，耗时13年。第二代测序技术一，基本原理基本原理：先进行文库制备，即将片段化的基因组DNA两侧连上通用接头；随后运用PCR扩增技术来产生几百万个空间固定的DNA簇，这种DNA簇由单个文库片段的多个拷贝组成，称PCR克隆阵列或称聚合酶克隆，最后进行测序。这些反应大规模同时进行，然后对每一步反应所产生的信号进行同时检测获得测序数据，再经过计算机分析获得完整的DNA序列信息。二，工作流程（一），文库制备1，将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末段再加上通用接头（adapter）制成片段文库。2，将基因组DNA打碎成300-800bp长的片段，将A和B接头（3’端和5’具有特异性）连接到DNA片段上。3，将基因组DNA打断后，与中间接头连接、环化，然后用EcoP15酶切，使中间接头两端各有27bp的碱基，最后加上两端的接头，形成配对末端文库。（二）DNA簇的产生：一般是通过PCR扩增产生DNA簇形成所谓的PCR克隆阵列，主要有两种方法：1，在芯片表面进行2，在磁珠进行二，工作流程三，测序技术1，边合成边测序（sequencingbysynthesis）技术在测序的flowcell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做BaseCalling.测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果2,焦磷酸测序（pyrosequencing）技术第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA

Polymerase、ATP

Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。第2步：向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA

聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。第3步在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息焦磷酸测序技术原理ppi:焦磷酸APS：5’腺苷-磷酰硫酸Lucifer:荧光素Apyrase:三磷腺苷双磷酸酶APS+ATP硫酸化酶荧光素酶3，连接测序（Oligoligationsequencing）技术(了解)

SOLiD第一代与第二代测序技术的比较

第一代测序技术凭借其在读长和准确率方面的优势，适合对新物种进行基因组长距离框架构建和后期Gap的填补，以及测序长度为kb—Mb级别的小规模项目，但在处理大批量测序任务和微量DNA样品测序时，成本高、速度慢、通量低，且需要大量专业技术人员全程操作。1990年启动的人类基因组计划(genomeproject)，耗资30亿美元，耗时13年完成，而第二代测序技术对人类基因组计划(genomeproject)的完成，只需要几天时间、几千美元。

第二代测序技术相比于第一代测序技术的整体优势在于高通量、耗资少。另外，不同原理的测序产品各有所长，如，SOLID4HQpackage将使每次运行产生300GB可定位的序列数据，其每个碱基需要测序两次，所以带来了99．99％的准确率；在新一代测序技术中罗氏454的读长仍最具优势，目前已增至400bp以上;Solexa较454具有读长相对较短、通量高、成本低的特点，适合于microRNA、转录组等小片段核苷酸的测序。

第三代测序技术及发展趋势第二代高通量测序技术已经得到很好的发展和应用，但是由于其测序速度、成本、准确度等关键问题任存在一定困难，故更高更新的测序技术逐渐面世，以将人类基因组测序的成本降到1000美元以下为终极目标，美国国立健康研究院/美国国立人类基因组学研究所(NIH/NIGRI)资助了几个小组以改进第二代测序技术或研发其他的测序方法，包括扫描隧道电子显微镜(ScanningTunnelingElectronMicroscope，TEM)，荧光共振能量转换(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET)，单分子检测(Single-moleculeDetection)和蛋白质纳米孔(ProteinNonopores)的应用。

1，基因组项目(全程测序)人，鼠，酵母，病原微生物，水稻，玉米等2，cDNA测序(EST或全长测序)

3，比较测序或杂合子测序单核苷酸多态性（SNP）的发现与验证突变检测BRCA,MSH2/MLH1,p534，依据于测序的分型试剂盒应用于法医的线粒体测序指导临床治疗的HIV基因型检测试剂盒针对16SrRNA的细菌鉴定试剂盒针对D2rDNA的真菌鉴定试剂盒5，小分子RNA研究DNA测序技术的应用第三节核酸数据分析一、核酸数据库二、数据库查询与检索三、核酸数据分析一、核酸数据库GenBank

GenBank数据库是由美国国家信息中心（NCBI）主持和维护。包含55000个物种所有已知的核酸序列和蛋白质序列以及与之相关的文献、著作和生物学注释。EMBIEMBI数据库是由欧洲分子生物学实验室主持维护的。DDBJDDBJ为日本DNA数据库。二、数据库查询与检索5354数据库检索工具Entrez检索工具：Entrez是美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的集成检索工具

/Entrez/SRS（SequenceRetrievalSystem）检索工具：是欧洲分子生物学网EMBnet的主要数据库检索工具，可以从

EMBnet的主页进入。

DBGET/LinkDB检索工具：是日本京都工具大学建立的

GenomeNet数据库，该数据库主要针对代谢途径。

http://www.genome.ad.jp/dbget/dbget_manual.html。55数据库检索工具NCBI网页的Entrez界面PubMed数据库检索文献检索文献检索

PubMed是美国国家医学图书馆(NLM)下属的国家生物技术信息中心(NCBI)开发的、基于WWW的医学数据库查询系统。PubMed的网址：/pubmed特点：收录范围广、内容全、检索途径多、检索体系完备，可少部分获取原文。文献检索三、核酸数据分析5960OUTLINE

核酸序列的基本分析核酸序列的比对分析和功能预测开放阅读框的分析引物设计向数据库提交序列61一、核酸序列的基本分析

核酸序列的分子量、碱基组成、碱基分布等基本分析：

BioEdit(/BioEdit/bioedit.html)

★DNAMAN(/)

限制性酶切分析：限制性酶数据库(RestrictionEnzymeDataBase,REBASE)(;

★

/rebase)

测序峰图的查看、核实与修改:Chromas,BioEdit,DNAMAN

测序结果需要识别与去除测序时使用的载体序列：

VecScreen(/VecScreen.html)62一、核酸序列的基本分析对核酸序列进行电子基因定位：利用序列标签位点(SequenceTaggedSite,STS);利用UniGene数据库进行基因电子定位;直接利用基因组序列进行基因电子定位。63★

NCBI网页的MapViewer界面程序名称查询序列搜索的数据库BLASTN核酸核酸BLASTP蛋白质蛋白质BLASTX核酸的六读框蛋白质TBLASTN蛋白质核酸的6个读框TBLASTX核酸的6个读框核酸的6个读框64二、核酸序列的比对分析和功能预测BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）是基本局域联配搜索工具；Blast功能有：6566NCBI网页的BLAST界面67686970NCBI网页的BLAST2SEQUENCES界面717273二、核酸序列的比对分析和功能预测FASTA：根据用户提交的单个序列进行数据库搜索比对的程序。网上服务器和电子邮件服务：

http://www.ebi.ac.uk/mailto:fasta@ebi.ac.ukhttp://www.fasta.genome.ad.jpmailto:fasta@nig.ac.jp74二、核酸序列的比对分析和功能预测进行多序列联配：ClustalW:http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html，

/soft/m