聚合酶链式反应(PCR)及电泳检测

聚合酶链式反应(PCR)及电泳检测聚合酶链式反应(PCR)及电泳检测一、实验目的学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法,及利用琼脂糖凝胶电泳检测纯度。2.掌握PCR反应体系的建立3.掌握PCR扩增技术的原理二、 实验原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)模拟DNA的天然复制过程在体外对DNA的特异序列进行扩增，从而获得大量的同一序列。与扩增的特异性密切相关的因素是与待扩增的特异序列两端互补的两个寡核苷酸引物。在含有模板、引物、聚合酶以及其他成分的反应体系中进行变性，退火，延伸三个阶段。它用加热的办法让所研究的DNA片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到DNA模板的两端，DNA聚合酶即可以大量复制该模板。然后对扩增的DNA进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定和纯化检测。三、 实验器具、材料及试剂器具:PCR热循环仪琼脂糖凝胶电泳系统材料、试剂:1、 DNA模板(template):入噬菌体的质粒DNA2、 dNTP:4种dNTP混和物3、 PCR缓冲液(buffer):10X组分如下:15mmol/LMgCl2，500mmol/LKCl，100mmol/LTris.HCl(pH8.3)， 0.1%明胶4、引物(primer):上游引物(M13F),下游引物(M13R)(见“实验指导”)6、TaqDNA聚合酶(Taqpolymerase)四、 实验步骤1、PCR反应体系的建立取0.2ml的薄壁离心管，按顺序加入试剂ddH2O37.7ul——dNTPs(2.5mMeach)4ul——引物1(10uM)1ul——引物2(10uM)ul——入DNAlul——10X反应缓冲液5ul——TaqDNA聚合酶0.3ul?稍混匀，短暂离心把溶液甩至管底。2、PCR的变温程序(热循环反应)设置PCR反应的变温程序94?(预变性)3min——94?(变性)30s——52?(退火)30s——72?(延伸)30s——72?(补充延伸)10min——4?(冷却)？把离心管放进PCR仪进行扩增?反应结束后低温保存并进行电泳检测。3、DNA浓度和纯度的检测PCR扩增产物的分光光度法检测。PCR扩增产物的电泳检测。五、 实验结果1.PCR扩增产物的分光广度结果如表1-1所示波长(nm)ABSOD260/OD280稀释倍数2600.6481.61191002800.402结论:根据纯DNA:0D260/0D280?1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白质，酚等污染)可知：1.6<1.6119<1.9，说明提起的DNA较纯，没有RNA，蛋白质酚等的污。2.PCR扩增产物的电泳结果如图1所示:

入DNADNA图1PCR反应产物的电泳图谱结论:根据图1可知，模板DNA的电泳图谱总共出现六条带，其分子量分别为2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp。提取的DNA通过在电泳图谱中与模板DNA的电泳图谱相对照，我们可以看出提取的DNA分子量为480bp左右，比较接近500bp，电泳过程中只出现一条带，说明提取的DNA是比较纯的.六、分析和讨论1•影响PCR反应的关键因素：(1)引物的质量与特异性，最佳的引物设计是PCR反应成功的最关键步骤，劣质的引物导致大量确定性结果，产生过多或过少的PCR产物，因此要求设计合适序列特性和稳定性的引物°(2)PCR循环条件(退火温度)，应该选择适合的温度；(3)Mg2+浓度，镁离子的浓度对维持酶的活性起着重要的作用;(4)模板DNA的质量，模板的浓度直接影响扩增的重复性，特异性和扩增的产量.过量的模板导致错配机会增大，从而非特异性增大，模板太少,扩增产物重复性不佳，常常PCR产物量不足以检测[2,3]。⑸酶的质量，酶是PCR扩增的关键因子,酶质量的好坏,浓度的大小直接影响着扩增的效果.研究结果表明:酶的质量和浓度直接影响扩增带的强弱，如果酶的浓度过低PCR产物过少难以检测[1]。2.琼脂糖凝胶电泳中可能出现的问题及原因(1)电泳过程中可能会出现无扩增条带的假阴性现象，其原因坑内是漏加模板、引物或酶;酶失效;引物不合适等(2)若电泳过程中出现非特异性扩增带的假阳性现象，其原因可能是退火温度偏低；引物不合适;Mg2+浓度不合适等。3.影响琼脂糖电泳迁移率的主要因素(l)DNA的分子量:在一定的电场强度下线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比，分子量大的DNA迁移速度相对慢;分子量小的DNA迁移速度相对较快°(2)DNA的构象:在一定的电场强度下，当分子量相同时，超螺旋的DNA分子因其密度大，迁移速度快，线性DNA迁移速度慢于超螺旋的DNA分子，而松弛型开环DNA的速度最慢。(3)琼脂糖浓度:一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。(4)电泳环境的影响:缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移速度。4(凝胶电泳的目的:可将大小不等的DNA片段和蛋白分子进行分离，并通过标准分子量maker鉴定其大小。对所要的目的分子进行纯化提取。六、参考文献胡稳奇.多聚酶链式反应技术(PCR)的发展及其应用J]•生物学通报,1992,3:11-12.朱新产等.PCR技术战略J]•生物技术通报，1998,3:29-33.[3]卢一凡等.提高PCR扩增大DNA片段的特异性和产量J]•遗传，1996,18(5):46-48.[4]Mullis