果蝇胚胎准备技术

果蝇胚胎准备技术邵素娟（果蝇资源与技术平台）—:概述黑腹果蝇（Drosophilamelanogaste是被人类研究得最彻底的经典模式生物之一。显微注射（microinjection）技术是制备转基因果蝇、RNAi（RNA干扰）果蝇、基因敲除（knock-out）果蝇等的非常重要的一项技术。果蝇显微注射主要包括以下几个步骤：1、背景果蝇胚胎的准备；2、注射用混合物（DNA、RNA）的准备；3、显微注射；4、G0代幼虫培养和杂交；5、G1代成虫筛选。果蝇胚胎的质量是整个显微注射的基础，是转基因等实验能否成功的重要影响因素。下面我就果蝇胚胎的准备技术做一个详细探讨。二：实验材料和方法实验材料均由果蝇资源与技术平台提供。以下以W1118为例阐述显微注射时果蝇胚胎的准备过程。1、 果蝇的扩繁。W1118果蝇的繁殖力强，每周一、三、五扩大瓶培养，每次4瓶，一般3周后就能持续得到足够数量的W1118果蝇。在扩繁的过程中，需要注意三点：一是要及时清瓶。一般瓶中幼虫发育到二龄时就需要把老果蝇清空，否则大瓶中果蝇产卵太多导致瓶中环境过湿，进而导致果蝇翅膀被粘而活力降低；二是在三龄幼虫爬上瓶壁后加纸（Kimwipers）。一般每瓶加入2~3张。这样不仅可以增加每瓶果蝇的产量，还可以使瓶内的环境干燥。三是大瓶内新一代的果蝇孵化后要及时将果蝇收集，否则，该大瓶会因其中的果蝇太多而粘湿，为以后收集果蝇带来不便。新收的果蝇一般继续培养2~3天后使用。2、 果蝇胚胎的收集。果蝇在25°C的环境中产卵。要想在做转基因注射时得到足够数量的胚胎，预产是必须的。在做显微注射前一天，将收集的果蝇放入胚胎收集器中，给予避光环境，使其在涂上新配酵母膏的果汁板上产卵。每隔一个小时换一块板。这样做能调整果蝇的昼夜节律，让他们适应白天产卵。如果预产卵时胚胎数量足够，就能准备做显微注射了。中午时将预产过的果蝇放入胚胎收集器中，之后每隔一小时左右收一次卵。果蝇的卵外层有比较坚硬的外壳，在注射前，需先去除外壳。将板上的卵先收集到漏斗中，用水将其中的酵母等杂质冲洗干净，然后用漂水去壳，接着用自来水冲洗1分钟，再用纯水冲洗半分钟后就完成了。在漂卵去壳过程中，漂水漂卵的时间是至关重要的因素。漂的时间过长，则胚胎容易破裂，而太短，则壳去除不干净，都影响接下来的显微注射。影响漂卵时间的因素主要有以下几个：一是漂水温度，漂水温度越高，需要漂的时间越短；二是漂水质量，不同批次的漂水，去壳的能力也不一样；三是果蝇卵的数量，一般卵的数量多，需要漂的时间也会长一些。3、 排卵。排卵最好在低温下完成，能延缓胚胎发育速度。在载玻片上贴一层双面胶（3M胶），将漂好的卵扫到双面胶下方，吸干水。在显微镜下将胚胎后端朝上依次排列成行。排好后，在环境中自然晾干。胚胎干湿度的控制是转基因能否成功的重要因素之一。胚胎过湿，在做显微注射时，容易爆；胚胎过干则会影响胚胎的成活率。4、 显微注射。胚胎排好后，在胚胎上方滴上一层矿物油保湿。为了及时调整胚胎的干湿度，每次只滴一小段胚胎，然后注射。当发现胚胎太干则会在下一次滴油的时候多滴一些，当发现胚胎太湿时，则会再多等几分钟后滴油，直到摸索出适合当天环境的时间为止。三总结显微注射时胚胎的准备过程中每一个步骤中都有技术要点。不管是哪一个步骤没有做好都会影响到胚胎的质量。其技术要点主要包括：1、 收集的果蝇量合适而且成熟度适宜，使显微注射时能够收集到足够的胚胎。2、 漂卵的时间控制得当，能够去除胚胎外面的壳且尽可能减少对胚胎的伤害。3、 排卵的时间控制得当，使胚胎干湿度适宜。4、 每次收卵的时间在一个小时