核酸化学4课件

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密码：123456第四章核酸化学本章内容●核酸的组成★RNA的结构★DNA的结构●核酸及核苷酸的性质●核酸的分离纯化●核酸的测定核酸的研究历史（1）染色质米歇尔（FriedrichMiescher，1844～1895）柯塞尔（AlbrechtKossel，1853～1927）列文（Levene）及Jacobs四核苷酸学说核酸的研究历史（2）1930～40年代Caspersson及其它人采用了超速离心、过滤、光吸收等方法测得DNA分子的分子量是50万到100万，比以前测得的1500大两个数量级。1928年Griffith的肺炎球菌实验1944年美国微生物学家艾弗里（O.T.Avery）、麦克劳（C.M.Macleod）和麦卡蒂（McCarty）采用肺炎球菌转化实验证实了遗传物质是DNA，不是蛋白质。核酸的研究历史（3）1953年，沃森和克里克提出了DNA的双螺旋结构，1962年获得诺贝尔奖现已证明，除了少数病毒以RNA为遗传物质外，多数生物体的遗传物质是DNA核酸的定量测定（定磷法）核酸的种类核酸的组成由许多核苷酸按一定顺序连接而成的多核苷酸核苷酸一、戊糖DNA：脱氧核糖RNA：核糖1‘1‘2‘2‘3‘3‘4‘5‘4‘5‘二、碱基（嘌呤和嘧啶）A、G、C、U、T酮式和烯醇式互变主要形式主要形式稀有碱基主要碱基的衍生物tRNA中含量较多三、核苷核苷是核糖或者脱氧核糖和嘌呤碱基或者嘧啶碱基生成的糖苷A、G、C、U碱基的顺式和反式碱基平面与戊糖平面垂直脱氧核苷dA、dG、dC、dT修饰核苷次黄苷（肌苷）I黄嘌呤核苷X四、核苷酸核苷的磷酸酯核糖：2’，3’，5’脱氧核糖：3’，5’AMP、GMP、dAMP多磷酸酯与高能磷酸键ATPCTPUTPGTPNADFAD三磷酸腺苷（ATP)五、核酸3’,5’-磷酸二酯键主链：磷酸和戊糖侧链：碱基一级结构：核苷酸残基的排列顺序5’5’3’3’核酸的简写式从左向右阅读，表示的碱基序列从5’到3’pGGTAOHGGTA六、核酸的水解碱水解酸水解:易导致N-苷键水解和碱基脱氨酶水解外切酶内切酶1、碱水解RNA用0.3mol/LNaOH在37℃处理16hr得到2’-核苷酸和3’-核苷酸DNA在此条件下不发生水解2、酶水解核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶内切酶、外切酶pApCp↓GpUpAC↓pGp第二节DNA的结构一、DNA的一级结构定义：脱氧核糖核苷酸在DNA分子中的排列顺序（序列）DNA基因与基因组基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位。

蛋白质（mRNA蛋白质）产物tRNARNArRNA

调节功能：调节基因无产物

作用未知结构基因基因组（genome）：某生物体所含全部遗传物质的总和。二、DNA的二级结构DNA双螺旋结构的理论基础1944年艾弗里（O.T.Avery）的肺炎球菌转化实验恰伽夫（Chargaff）证明在任何类型的生物中腺嘌呤A和胸嘧啶T的比值以及鸟嘌呤G和胞嘧啶C的比值总是接近于1;含氨基的碱基总数等于含酮基碱基总数，即A+C=G+T;嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T。伦敦皇家学院的威尔金斯（MauriceWilkins）的DNAX射线衍射图像

DNA的双螺旋结构，由Watson，Crick于1953年提出。DNA双螺旋结构的要点1两条反向平行多核苷酸链，磷酸核糖骨架在外2.0nm小沟大沟DNA双螺旋结构的要点2

碱基配对（碱基互补）A－T，G－C

碱基平面与螺旋轴、脱氧核糖平面垂直大沟与小沟DNA双螺旋结构的要点3右手双螺旋，直径2nm，螺距3.4nm，10核苷酸/螺圈该条是可变DNA双螺旋的不同类型A型：11/0.23nmB型：10/0.34nmZ型：左手螺旋12/0.38nm三者的螺旋参数不同B型最稳定,生物体主要为B-DNA三、DNA的三级结构DNA双螺旋结构的进一步扭曲双链线状双链环状超螺旋氢键：使四种碱基形成特异配对关系，G-C间可形成3对氢键，A-T之间有两对氢键。疏水相互作用：轴向平行相邻的碱基平面自发地相互靠近，使碱基缔合，形成碱基堆积力，它是使DNA结构稳定的主要力量。离子键：磷酸残基上的负电荷与介质中的正离子，如Na+，K+，Ｍg＋等之间形成的离子键。稳定DNA双螺旋结构的三种力DNA的双螺旋结构的意义

该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。

该模型的提出是20世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。第三节RNA的结构RNA的种类细胞质rRNAtRNAmRNA细胞核迁移性（前体RNA）非迁移性：染色质RNA细胞器线粒体叶绿体病毒RNARNA的一级结构

RNA分子中各核苷之间的连接方式（3´-5´磷酸二酯键）和排列顺序叫做RNA的一级结构OHOHOH5´3´

RNA与DNA的差异

DNARNA糖脱氧核糖核糖碱基AGCTAGCU不含稀有碱基含稀有碱基RNA的高级结构多数天然RNA分子为一条单链，一些区域可自身回折，形成局部的双螺旋一、tRNA最小（分子量2～3万）占细胞RNA总量的15％作用：将氨基酸转移到核糖体-mRNA复合物的相应位置，用于蛋白质的合成

二级结构：三叶草模型

l

氨基酸臂：

7对碱基对组成，富含G，包括3’和5’两个末端。

3’-末端最后三个碱基CCA-OH，接受活化氨基酸。

l

二氢尿嘧啶环：含两个二氢尿嘧啶。

环：由8-12个核苷酸组成。

臂：由3-4对碱基对——二氢尿嘧啶臂。

l

反密码子环

环：7个核苷酸组成，环正中三个核苷酸为反密码子。

臂：由5对碱基组成。L可变环

由3-18个核苷酸组成，环大小变化较大，不同的

tRNA具有大小不同的可变环。

l

TΨC环

环：由7个碱基组成，大多tRNA均含T和Ψ。

T——胸腺嘧啶核糖核苷

Ψ——假尿嘧啶核苷

臂：由5对碱基组成。tRNA三级结构的共性大小相似、三维构象相似有利于携带氨基酸的不同tRNA进入核糖体特定部位三级结构：倒写的字母L二、rRNA分子量最大（106）占RNA总量的80％主要存在于核糖体5sRNA的二级结构三、mRNA决定相应蛋白质的氨基酸序列占RNA总量的3～5％小结：DNA和RNA的比较

RNA

DNA组成戊糖核糖脱氧核糖碱基

A,G,CA,G,C

U

T磷酸

Pi(磷酸二酯键)Pi(磷酸二酯键)结构单链，部分碱基互补，局部双螺旋，三叶草形等双链，碱基互补，双螺旋形分布细胞核(核仁)，细胞质(线粒体、核蛋白体、胞液)细胞核(染色质)细胞质(线粒体)生物功能遗传信息表达，反转录，直接参与蛋白质的生物合成遗传的物质基础，负责遗传信息贮存，发布，转录小结：蛋白质和核酸的比较组成单位单位的种类连接方式一级结构空间结构功能第四节核酸的性质

一、物理性质DNA：白色纤维状固体RNA：白色粉末核苷酸、核苷、碱基：白色粉末或结晶微溶于水，不溶于有机溶剂二、两性电解两性电解质，通常表现为酸性RNA等电点：2.0～2.5DNA等电点：4～4.5三、核酸的紫外吸收260nm增色效应减色效应DNA浓度（ug/ml)=A260/0.02RNA浓度（ug/ml)=A260/0.024四、核酸的变性变性：双螺旋区域氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规则线条状态降解：磷酸二酯键的断裂增色效应和熔解温度Tm影响Tm的因素DNA的熔解温度85～90℃G-C碱基对的含量Tm=(G+C)%×0.41+69.3溶液的离子强度溶液pH变性剂DNA的变性方法热变性90℃以上酸碱变性低于3或者高于10，常用碱变性化学试剂变性尿素、甲醛五、核酸的复性变性核酸的互补链在适当条件下重新形成双螺旋的过程，又称退火复性温度(Tm-25o)影响因素片断浓度片断长度重复序列数目较低的离子强度复性的应用：分子杂交不同来源但是具序列互补性的两条DNA或DNA与RNA或两条RNA通过碱基配对原则结合在一起的过程。应用于基因标记、定位。例如用带有标记的单链DNA或RNA做“探针”，通过分子杂交可以从生物样品中查找到需要的DNA或RNA。通常“探针”都是小片段核酸（寡核苷酸），可以人工合成。六、核酸的测定紫外吸收法定磷法RNA的测定DNA的测定5’-核苷酸的测定1、紫外吸收法DNA：A260/A280=1.8RNA：A260/A280=2DNA提取时偏大（RNA污染）偏小（蛋白质或酚污染）2、RNA定量测定（苔黑酚法）样品中蛋白质含量高时，应先用5％三氯乙酸溶液处理后再测定，否则发生干扰；3、DNA定量测定（二苯胺法）第五节核酸的分离纯化原则防止核酸酶降解EDTA防止化学因素降解强酸、强碱防止物理因素降解高温、剧烈搅拌一、沉降超速离心法65000rpm6hr紫外照射二、凝胶电泳最常用琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶影响因素与分子量对数成反比与胶浓度成反比构象：超螺旋DNA>线性DNA电流第六节核酸的测序DNA测序的意义研究核酸结构和功能的关系寻找基因和改造基因疾病诊断推断蛋白质氨基酸序列一、末端中止法将待测DNA加热变性成为单链，作为合成的模板；加入与模板5’-端互补的短链作为引物；将样品分为四份，加入四